| Лаборатория иммунологии и биологии клетки |
|
24 августа 1927 года - дата первого привоза обезьян в Сухуми - считается датой рождения крупнейшего в мире питомника обезьян, выросшего в ИЭПиТ АМН СССР- мощную базу медицинской приматологии. Лаборатория экспериментального рака создана в 1937 г. по инициативе заслуженного деятеля наук профессора Н.Н.Петрова. Работа по воспроизведению экспериментального рака была начата в 1939 г., ко времени начала этих исследований литературные данные об экспериментальном канцерогенезе отсутствовали. В 1948 году под руководством родоначальника советской онкологии Н.Н. Петрова ( стажировавшегося у И.И. Мечникова) получена первая в мире злокачественная опухоль в эксперименте на обезьянах- сначала с помощью химического, затем радиоактивных канцерогенов. Работа показала принципиальную возможность получения экспериментального рака у обезьян. За это уникальное исследование в 1953 г.была получена золотая медаль им. И.И.Мечникова , а в 1964 г. по совокупности работ в области экспериментальной онкологии Н.Н.Петров был удостоен Ленинской премии. Успех был достигнут и в области изучения вирусной этиологии опухолей. Под руководством основателя отечественной онковирусологии Л.А.Зильбера Б.А.Лапиным и Ф.И .Аджигитовым были начаты исследования по воспроизведению на обезьянах рака с помощью вируса куриной саркомы Рауса. Эта работа увенчалась успехом. Рак был индуцирован у новорожденных обезьян. Эти исследования имели колоссальное значение, поскольку было показано, что онкогенный вирус может преодолевать не только видовые, но и межклассовые барьеры, т.е. онкогенный вирус птиц способен индуцировать опухоли у животных отряда приматов, к которым относится и человек. Эти исследования получили продолжение, но уже на более высоком уровне. В 1967 г., когда академик Лапин Б.А. выдвинул гипотезу о вирусной причине опухолей человека, против чего существенно возражали онкологи-клиницисты, в НИИЭПиТ АМН СССР начались исследования по изучению роли вирусов в возникновении лимфом\лейкозов человека в эксперименте на обезьянах. Эти исследования проводились большой группой исследователей различных направлений (клиницистов, патоморфологов, молекулярных биологов, иммунологов, вирусологов, культуральщиков, и др.) под руководством академика Лапина Б.А. и профессора Яковлевой Л.А. Впервые в мире на макаках бурых и павианах гамадрилах была получена злокачественная лимфома, после введения обезьянам крови больных лейкозом людей. Была показана горизонтальная передача заболевания от больногого животного здоровому. Учитывая эти факты, попытки выделения вируса/ов имели реальную почву и были обоснованы.
В 1960г. лаборатория онкологии (зав. проф. Яковлева Л.А) существовала в составе отдела патологии (зав проф. Лапин Б.А.) В 1986 г. лаборатория экспериментальной онкологии вышла из отдела патологии и стала самостоятельной лабораторией. В 1988 году лаборатория экспериментальной онкологии ИЭПиТ АМН СССР была реструктурирована в отдел (зав. профессор Яковлева Л.А.) и разделена на 3 лаборатории: онкогенных вирусов приматов (зав.д.м.н. Агрба В.З.), молекулярной биологии (зав. д.м.н. Дьяченко А.Г.) и иммунологии (зав. д.м.н. Воеводин А.Ф.). Общим направлением научной деятельности отдела продолжало оставаться - изучение роли вирусов в онкогенезе в отряде приматов. Целью работы лаборатории онкогенных вирусов (в рамках общей программы) являлось: 1) выделение онкогенных вирусов приматов в культурах клеток, в том числе выведение новых вируспродуцирующих культур клеток от обезьян и людей, страдающих онкогематологическими заболеваниями; 2) изучение характеристик вируспродуцирующих культур клеток, а также вирусов в них реплицирующихся; 3) доказательство онкогенных потенций выделенных вирусов в опытах in vivo. После распада СССР и образования самостоятельных республик правоприемником НИИЭПиТ АМН СССР стал один из его филиалов, ныне существующий как НИИ МП РАМН, а ИЭПиТ попал под юрисдикцию органов управлении республики Абхазия. В период грузино-абхазской войны 1992-1993 гг. материальная база и инфраструктура НИИЭПиТ значительно пострадали, финансирование носило спорадический характер, осуществлялось нерегулярно и, в зависимости от положения на фронте, финансировалось то одной, то другой конфликтующей стороной. Большая часть квалифицированных научных кадров перебазировалась во вновь организованный НИИ МП РАМН. Лаборатория онкогенных вирусов приматов была создана уже под новым названием - лаборатория иммунологии и онковирусологии и укомплектована прибывшими из Сухума кадрами. Как уже было сказано выше, целью исследований группы онкогенных вирусов приматов (позднее трансформированной в лабораторию) было выделение онкогенных вирусов от больных злокачественной лимфомой обезьян. Многочисленные попытки выделить вирус в пермиссивных культурах клеток не увенчались успехом. Непосредственное культивирование клеток кроветворных тканей больных лимфомами обезьян и электронномикроскопическое изучение полученных краткосрочных культур выявляло частицы ретровируса типа С, но идентифицировать на тот период этот вирус так и не удалось Успех пришел позднее, после 1980 г., когда от взрослых людей, страдающих Т-клеточной лейкемиией в Японии и регионах Карибского моря, был выделен ретровирус типа С, позднее верифицированный как HTLV-1 и имеющий антигенное сходство с вирусом, выделяемым в короткоживущих культурах крови, а также ультрацентрифугатах крови, мочи и др.тканях больных обезьян. Этот ретровирус типа С,обнаруживаемый в тканях лимфоматозных обезьян, был назван STLV-1 При культивировании опухолевых клеток павианов гамадрилов впервые в мире нам удалось получить суспензионных лимфоидные культуры клеток, в 3-10% которых электронномикроскопически обнаруживались частицы с морфологической структурой вируса герпеса..
Специфика выделения вируса, его морфологическая структура, сходство с капсидным антигеном вируса ВЭБ – первым онкогенным вирусом человека, выделенным в 1964 г.от больного африканской лимфомой Бёркитта человека, отличие ядерных антигенов двух вирусов, а также лишь 40% гомология ДНК двух вирусов позволило установить биологическую уникальность выделенного от обезьян вируса и назвать его ГВП (лимфотропный герпесвирус павианов). Этот факт послужил основанием академику Лапину Б.А. и сотрудникам выдвинуть гипотезу о существовании семейства лимфотропных вирусов приматов, объединенных в одну группу ВЭБ-подобных вирусов приматов. Несколько позже эта гипотеза получила подтверждение выделением нами от других видов обезьян аналогичных вирусов. Так, от макаков бурых был получен ряд суспензионных лимфоидных линий, в клетках которых реплицировался аналогичный лимфотропный вирус, названный ГВМА, от зеленых мартышек – ГВЗМ. Все эти вирусы были выделены в лимфоидных суспензионных культурах клеток, выведенных от соответствующего вида обезьян. Было доказано горизонтальное распространение лимфотропных герпесвирусов, путем выделения биологически активного вируса из смывов зева обезьян как больных злокачественной лимфомой, так и обезьян, находящихся в стадии клинической ремиссии. Что касается ретровируса типа С, обнаруживаемого нами в органах и тканях больных лимфомой обезьян, то иммунологически было показано, что этот вирус не имел аналогов среди известных на то время ретровирусов млекопитающих ( кошек, мышей, крупного рогатого скота и др.). Первично этот вирус по месту первичного обнаружения был условно назван нами «плазменным» и позже идентифицирован как STLV-1 из семейства HTLV-1. Результаты молекулярно-генетических исследований подтвердили принадлежность обоих вирусов к одному семейству. Позже при культивировании Т-клеток злокачественной лимфомы павиана гамадрила, удалось вывести Т-клеточную постоянную культуру, продуцирующую указанный вирус. Проведенное молекулярно-генетическое исследование ретровирусов, в том числе ключевых участков его генома ( env и tax – генов ), присутствующих в клетках лимфом павианов и макаков в виде провирусной ДНК (с помощью ПЦР-амплификации с последующим секвенированием и компьътерныи анализом) позволило установить существенную гомологию структуры изучаемых ретровирусов обезьян с прототипным ретровирусом человека HTLV-1. Т.о. в лаборатории впервые в мире выведены лимфоидные суспензионые постоянные культуры клеток обезьян ( павианов гамадрилов, макаков бурых и зеленых мартышек), депонированные в КККП ( коллекция культур клеток позвоночных ) при Институте цитологии РАН.(бывшая ВСКК). Одна постоянная культура клеток [( СПГ-7(Т)], выведенная из опухолевых клеток павиана с Т-клеточной лимфомой, имеющая Т-клеточный фенотип- сдана в Американскую коллекцию клеточных культур ( АТСС). В общей сложности депонированы в различные коллекции страны 11 авторских постоянных лимфоидных культур приматов ( человека и обезьян). Лимфотропные герпесвирусы из семейства ВЭБ: герпесвирус павианов ( ГВП ), макаков бурых ( ГВМА) и зеленых мартышек ( ГВЗМ ), а также ретровирус типа С- STLV-1 из культуры СПГ(Т) депонированы в Государственную коллекцию вирусов при НИИ вирусологии им. Ивановского РАМН. ГВП вызывает волнообразнопротекающее лимфопрорлиферативное заболевание у 6-дневных павианов гамадрилов, характеризующееся лимфаденопатией, спленомегалией и лимфоцитозом в периферической крови.В общем комлексе (патоморфологическое исследование аутопсийных материалов, клиническая картина и гематологические показатели) вирусиндуцированный патологический процесс можно было охарактеризовать е как предлимфому. ГВП в сочетании с STLV-1 в 75% случаев вызывает злокачественную лимфому у кроликов. ГВМА в 100% случаев вызывает у кроликов смертельную генерализованную злокачественную лимфому, первые клинические признаки которой у инокулированных беспородных кроликов сухумской разводки появляются через 24-60 дней после инокуляции. 30-60%. ГВЗМ в сочетании с STLV-1 в 25% случаев вызывает у 2-3 месячных кроликов смертельную генерализованную лимфому.. За цикл работ, посвященных изучению биологических, иммунологических и молекулярно-биологических характеристик лимфотропного герпесвируса павианов (ГВП),(1978-1982) коллектив авторов Б.А.Лапин ( руководитель), Л.А..Яковлева (руководитель), Агрба В.З., Воеводин А.Ф., Дьяченко А.Г., Тимановская В.В. в 1984 г. были удостоены премии им. В.Д. Тимакова. За цикл работ «Роль вирусов в возникновении злокачественных лимфом приматов и пути горизонтального распространения вирусов и заболевания» авторы Лапин Б.А. (руководитель), Агрба В.З., Инджия Л.В., Чикобава М.Г., Яковлева Л.А. были удостоены высшей награды страны в области науки и техники за 2002 год Государственной премии Российской Федерации. Лаборатория иммунологии и биологии клетки была создана в 2008 г на базе лаборатории иммунологии и онковирусологии, что полностью соответствовало направлениям научных исследований лаборатории.
Основными научными направлениями лаборатории являются:-Выведение и изучение культур мезенхимальных стволовых клеток приматов. Создание криобанка мезенхимальных стволовых клеток приматов. Изучение возможностей использования культур мезенхимальных стволовых клеток для заместительной клеточной терапии социально значимых заболеваний людей в эксперименте на обезьянах. Основные задачи лабораторииОсновными задачами научно-исследовательской работы лаборатории являются: 1. Создание банка культур мезенхималных стволовых клеток приматов разных видов и изучение возможности их использования в качестве заместительной клеточной терапии социльно значимых заболеваний людей в эксперименте на обезьянах,; 2. Изучение факторов неспецифической резистентности у обезьян.Изучение влияния способности животных к продукции цитокинов ( интерферонов и интерлейкинов))- их роли в иммуногенезе у приматов и влияние на возникновение и течение заболеваний. 3. Изучение влияния способности животных к продукции цитокинов ( интерферонов и интерлейкинов))- их роли в иммуногенезе у приматов и влияние на возникновение и течение заболеваний. 4. Изучение и установление нормативых показателей клеточного звена иммунитета обезьян с помощью проточной цитофоориметрии и установление влияния хронического гамма-облучения на состояние клеточного звена иммунитета у обезьян ( программа «Гамма-Бриз») 5. Установление инфицированности обезьян латентными вирусами приматов, изучение влияния этих вирусов на состояние гуморального и клеточного иммунитета , состояние регуляторной цитокиновой систем и изменения в картине крови; 6. Иммунофенотипирование клеток культур мезенхимальных стволовых клеток приматов. 7. Получение культур мезенхимальных стволовых клеток приматов и формирование криобанка этих культур. Создание модели острого инфаркта миокарда на обезьянах и испытание терапии клетками мезенхимальных культур в качестве заместительной. 8. Выявление онкогенных вирусов приматов и определение их роли в онкогенезе .
В соответствии с поставленными перед ней задачами лаборатория осуществляет следующие функции:1. Разрабатывает текущие и перспективные планы научно-исследовательских работ, осуществляемых в рамках научной тематики лаборатории. 2. Проводит по утвержденному дирекцией и РАМН тематическому плану научно-исследовательские работы, направленных на получение новых научных данных, а также решение конкретных научно-технических проблем, в пределах разрабатываемой тематики. 3. Проводит исследования на хоздоговорных началах по согласовании с дирекцией 4. Осуществляет подготовку научных кадров через аспирантуру, повышение квалификации кадров и выполнение диссертационных работ. 5. На лабораторных конференциях рассматривает и обсуждает научно-исследовательский план лаборатории и его выполнение. 6. Осуществляет подготовку научных отчетов, статей и докладов к публикации 7. Осуществляет связь с другими лабораториями для проведения при необходимости комплексных исследований, а также с целью обмена опытом и полученными данными для использования их при решении поставленных перед лабораторией задач. 8. Изучает и разрабатывает рекомендации по использованию и внедрению полученных научных результатов в народное хозяйство
В лаборатории выполняются плановые научные темы:1. Установление нормативных показателей клеточного и гуморального иммунитета у приматов в сравнении с состоянием естественной реактивности и спектром продуцируемых цитокинов.» Рук. Агрба В.З., Отв. Исп. Карал-оглы Д.Д. 2. Выведение культур и формирование банка мезенхимальных стволовых клеток приматов и попытки их использования в качестве заместительной клеточной терапии при экспериментальной кардиомиопатологии» Рук. Лапин Б.А., отв. Исп. Агрба В.З. Гранты РФФИ: 1. № 02-04-49671 «Создание специализированной коллекции В- и Т-клеточных лимфоидных культур приматов» 2003-2005 2. № 06-04-06747 «Мониторинг латентных вирусных инфекций приматов Адлерского питомника» 2006-2008 3. № 06-04-48025 « Получение и характеристика культур стволовых клеток приматов –макаков резус и павианов гамадрилов- и возможные области использования» 2006-2009 4. № 09-04-00509 « Создание банка мезенхимальных стволовых клеток лабораторных приматов и использование их для клеточной терапии социально значимых заболеваний людей в эксперименте на обезьянах» 2009-2011 В результате проведенных в 2005-2010гг. исследований получены научные результаты, имеющие не только научное, но и практическое значение:1) Впервые установлены нормативные показатели ИФН-статуса (ИФН-α, ИФН-γ, ИФН-сп, ИФН-сыв) –как одного из ведущих факторов неспецифическойрезистентности – у 5 видов обезьян Адлерского питомника. На 101 обезьяне разного вида, возраста и пола показано, что показатели ИФН-статуса обезьян максимально приближены к таковым у человека. [Агрба В.З., Карал-оглы Д.Д., Игнатова И.Е. и др. Наука Кубани,2009, №1, стр. 14-16] . Выявлена существенная разница в продукции ИФН-он у обезьян разного возраста и не отмечено зависимости продукции ИФН-ов от пола животного. Установлена выраженная депрессия функционирования системы ИФН у животных с кишечной патологией инфекционной этиологии [Агрба В.З., Лапин Б.А.,Карал-оглы Д.Д. и др .БЭБиМ, 2009, №8, с. 223-225]. Защищена кандидатская диссертация: Карал-оглы Д.Д.«Система интерферона низших обезьян в норме и при некоторых видах инфекционной патологии.» С-Петербург, 2007 2) Впервые методом проточной цитометрии у макаков резус 2-7 лет установлены нормативные показатели клеточного звена иммунитета . Показано, что показатели иммунного статуса макаков резус максимально приближены к таковым у людей.[ Игнатова И.Е., Агрба В.З., БЭБиМ, 2010, №1, с. 93-96] 3) В рамках темы «Гамма-Бриз», являющейся фрагментом Федеральной программы «Марс-500» методом проточной цитометрии установлена наибольшаярадиочувствительность В-клеток по сравнению с Т-лимфоцитами и резистентность НК-клеток к малым дозам облучения (250сГр). Показано, что число иммунокомпетентных клеток восстанавливается раньше у обезьян после однократного облучения , чем после фракционного[ Игнатова И.Е., Агрба В.З., Лапин Б.А. БЭБим, 2010 ] 4) Установлено, что инфицирование обезьян латентными вирусами приматов (STLV-1,HB,CMV) не влияет на функционирование некоторых физиологических систем организма обезьян .Публикуется в статье « «Картина крови и интерфероновый статус у обезьян, инфицированных латентными вирусами приматов. [ Карал-оглы Д.Д., Игнатова И.Е., Гварамия И.А и др БЭБиМ , 2010,] 5) Проводится мониторинг латентных вирусных инфекций у обезьян разных видов методом ИФА. Изучалось наличие антител класса IgG к вирусу иммунодефицита обезьян SIV, Т-клеточного лейкоза приматов ( STLV-1), ретровируса приматов ( SRV), герепесвирусу обезьян ( HB) , цитомегаловирусу (СMV). Показано, что распространенность SIV у зеленых мартышек составляет 35%, у макаков- 7,8%, у павианов – 19,6%.. Наличие антител к вирусу STLV-1 выявлялось у зеленых мартышек- 27,3%, у павианов – 24,7%, у маков резус- 1,6%. Антитела к вирусу герпеса у разных видов обезьян определялось на уровне 46,9%, причем наибольшее число вирусоносителей определяется среди павианов- 74%, затем среди макаков резус-49,9%, у зеленых мартышек вирусоносительноство составляет 40,9%. При обследовании 86 обезьян разных видов на носительство CMV вирусоносительство составило 63%, наибольшее их число определялось среди зеленых мартышек-63%. [ Вышемирский О.И., Суханова Л.Л., Гварамия И.А. и др. В сб. «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» Сочи-Адлер, 2006, с.97-100; Карал-оглы Д.Д., Вышемирский О.И., Агрба В.З. В сб.» Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» 2007, Сочи-Адлер, с. 149-153] 6) Проводится изучение гематологических показателей обезьян в сравнении с таковыми у человека. Установлены следующие особенности картины крови у обезьян по сравнению с человеком: существенное снижение СОЭ ( 0,5-2 мм/час); у павианов определяется преимущественно нейтрофильный ( как и у людей) профиль, а у макаков резус- преимущественно лимфоидный. Число лейкоцитов в периферической крови завышено по сравнению с человеком и составляет 15-20х109 /л. 7) Впервые создана специализированная коллекция В- и Т-клеточных лимфоидных культур приматов а) Защищена кандидатская диссертация на тему:» Антигенная характеристика культивируемых ин витро лимфоидных клеток приматов» 2003г. б) Для внутри – и межинститутского использования написано «Руководство по получению, культивированию и изучению характеристик лимфоидных суспензионных культур клеток приматов».Сочи, 2004. 8).Впервые создан банк культур мезенхимальных стволовых клеток костного мозга 2-х видов обезьян: макаков резус и павианов гамадрилов. Культуры клеток существуют в настоящее время на уровне 3-40 пассажа культивирования без признаков морфологической трансформации. Используя в качестве фактора дифференцировки 5-азацитидин получены культуры миобластов, морфологически отличающиеся от фибробластов.
9) Изучается иммуноморфологическая характеристика клеток костного мозга в динамике в процессе культивирования. В 11 субпассаже культивирования отмечается стойкий CD34-,CD45-CD90+ иммунофенотип клеток. 10) На 5 обезьянах (4 павианах гамадрилах и 1 макак резус) методом наложения лигатуры на переднюю коронарную артерию был получен острый инфаркт миокарда, документированный на ЭКГ и наличием биохимических маркеров ( тропонин, креатинкиназа, креатинкиназа СВ, АЛТ, АСТ). 2 павианам гамадрилам с экспериментально индуцированным инфарктом миокарда были введены системно МСК 10 млн клеток на 1 кг веса тела. У контрольных ( не получивших МСК) и экспериментальных ( получивших МСК)обезьян клиническая и лабораторная картина острого инфаркта миокарда протекала сходно. Уже через 17 дней (иногда раньше) после наложения лигатуры (видимо из-за развития коллатерали) отмечалось возвращение интервала ST к изолинии и рубцовые изменения в миокарде. Состояние обезьян после воспроизведения экспериментального инфаркта миокарды остается удовлетворительным на протяжении 1 года. Существенных отличий в клинической картине и лабораторных показателях у контрольных и опытных животных не наблюдали.
В настоящее время штат лаборатории иммунологии и биологии клетки следующий:
Группа молекулярной биологии
|
