07 | 08 | 2020
Кебурия В.В., Корзая Л.И, Крылова Р.И., Лапин Б.А Длительное динамическое наблюдение за HCV-позитивными макаками Адлерского приматологического центра

ДЛИТЕЛЬНОЕ ДИНАМИЧЕСКОЕ НАБЛЮДЕНИЕ ЗА HCV-ПОЗИТИВНЫМИ МАКАКАМИ АДЛЕРСКОГО ПРИМАТОЛОГИЧЕСКОГО ЦЕНТРА.

Кебурия В.В., Корзая Л.И, Крылова Р.И., Лапин Б.А.

Ранее нами были выявлены сывороточные маркеры, свидетельствующие о циркуляции среди низших обезьян Старого Света вируса гепатита С (HCV) или близкородственного ему HCV-подобного штамма обезьян [2, 3, 4]. Показатели естественного гуморального иммунного ответа к HCV у макак и других низших обезьян обладали рядом особенностей по сравнению с таковыми у человека. Отмечалось большое разнообразие спектра антител в отношении основных диагностических белков HCV, преобладание антител к неструктурным белкам вируса у значительного числа обезьян, а также невысокая их реактивность [2, 4, 5 ]. Одной из особенностей являлось также наличие довольно большой доли макак (57,7 %), имеющих антитела только к одному из белков HCV, что при диагностике гепатита С у человека расценивается как "неопределенный результат", требующий продолжения исследования образцов сыворотки в динамике до установления окончательного диагноза [1]. В связи с этим, представлялось важным провести динамическое наблюдение за серологическим и вирусологическим статусом таких обезьян, а также осуществить их биохимическое и морфологическое обследование. Кроме того, необходимо было осуществить дальнейшее наблюдение за обезьянами, уже имеющими специфические и неспецифические маркеры HCV-подобной инфекции, а также сопоставить их с аналогичными показателями у человека.

Динамическому наблюдению было подвергнуто 18 серопозитивных по анти-HCV обезьян, в том числе 13 макак резусов (Macaca mulatta) и 5 макак яванских (M. fascicularis).

Для определения анти-HCV использовали коммерческие диагностические тест-системы -«ИФА-АНТИ-HCV», «ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР» и «ИФА-АНТИ-HCVc-M» производства «Диагностические системы» (Нижний Новгород), а также «ГепаСкринтм» и «Анти-HCV-ИФА-подтверждающий тест» производства ДГУ ЭПП «Вектор - БиАльгам» (Новосибирск). 

Детекцию РНК HCV в положительных на анти-HCV сыворотках крови обезьян осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс HCV-240 / ВКО-440» производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (Москва) согласно прилагаемой инструкции.  

Была изучена динамика антителообразования и выявляемость других маркеров гепатита С (вирусологических, биохимических и морфологических) у макак резусов. С этой целью нами было отобрано несколько особей с низкой реактивностью сывороток в отношении анти-HCV, предполагая, что эти обезьяны могут находиться на ранней стадии сероконверсии. Наиболее характерные результаты таких исследований представлены на примере одной из обезьян (макака резуса № 32740) в течение 6 месяцев наблюдения (табл. 1). Время наблюдения за обезьяной было условно разделено нами на два периода. В первый период (-54, -14, -9, -7, -5 дни) сывороточные маркеры инфекции у обезьяны отсутствовали, а во второй период (1 – 126 дни) наблюдалось их динамическое развитие. За первый день наблюдения мы условно приняли дату, когда у обезьяны впервые были выявлены анти-HCV, причем, реактивность сыворотки была низкой (ОП492 равнялась 0.290). Как видно, в течение двух месяцев после первичной детекции анти-HCV в сыворотке этой обезьяны наблюдалось постепенное и интенсивное нарастание их уровня до максимального (ОП492 1.903) к 66 дню, а затем - такое же интенсивное снижение (ОП492 0,696) к 94 дню. В течение четвертого месяца наблюдения показатели оставались примерно на таком же уровне (ОП492 0,477-0,679)

Охарактеризована также динамика антителообразования в отношении основных белков HCV (табл. 1). Следует отметить, что первыми были обнаружены анти-core – практически одновременно с первичной детекцией суммарных антител, затем наблюдалось постепенное повышение их уровня к 24 дню (ОП492 составила 0,756). В дальнейшем показатели анти-core оставались на низком уровне (ОП492 колебалась от 0,289 до 0,399) до конца срока наблюдения. Вторыми по сроку (на 10-е сутки) появились анти-NS4 (ОП492 равнялась 0,320), постепенно достигая максимальных величин (ОП492 составила 1,478) к 63 суткам наблюдения. Затем происходило постепенное снижение их уровня (ОП492 равнялась 0,463) к 114 суткам. На 9-е сутки были также обнаружены и анти-NS5, но значения их уровня были очень низкими (ОП492 равнялась 0,284-0,333) и сохранялись они лишь непродолжительный срок (с 9 по 56 сутки). Позже всех были обнаружены анти-NS3 – c 63 суток после первичной детекции суммарных антител и их уровень был невысоким (ОП 492 составила 0,327-0,456 до конца срока наблюдения). Следует отметить, что антитела класса М не были выявлены на протяжении всего срока наблюдения.

Как видно из табл. 1, на фоне положительной динамики антителообразования у макака резуса № 32740 периодически  отмечался повышенный уровень АлАТ в течение месяца (на 49, 52, 56, 70 и 87 сутки после первичной детекции анти-HCV).

Таблица 1.

Характеристика специфических и неспецифических маркеров  естественной

HCV-инфекции у  макака резуса № 32740.

Дни наблю-дения

Маркеры HCV-инфекции

анти-

HCV*

анти-

core

анти-

NS3

анти-

NS4

анти-

NS5

анти-

core

Ig M

РНК

HCV**

АлАТ***

-54

0,149

0,085

0,098

0,100

0,075

0,20

-14

0,27

-9

0,162

0,263

0,230

0,143

0,148

0,24

-7

0,23

-5

0,25

1

0,290

0,112

0,20

3

0,291

0,191

0,155

0,177

0,23

8

0,370

0.111

0,23

10

0,562

0,544

0,244

0,320

0,318

0,18

14

0,23

17

0,626

0,099

0,23

21

0,26

24

0,822

0,756

0,233

0,650

0,485

0,110

0,23

28

0,25

31

0,27

35

0,34

38

0,29

43

0,102

0,23

45

0,987

0,321

0,225

0,881

0,284

0,09

49

0,49

52

0,098

-

0,56

56

1,298

0,289

0,171

0,970

0,333

0,45

59

1,317

0,081

-

0,1

63

0,310

0,344

1,478

0,207

-

0,31

66

1,903

0,088

-

0,31

70

-

0,5

73

0,36

76

+++

0,31

80

0,299

0,437

1,168

0,210

+++

0,12

84

1,489

+++

0,16

87

+

0,41

90

1,344

0,18

92

0,881

++

0,25

94

0,696

0,097

++

0,23

97

0,399

0,456

0,506

0,256

++

0,23

99

0,675

0,36

101

++

0,34

104

++

0,23

107

0,679

0,29

111

0,634

0,27

114

0,477

0,272

0,327

0,463

0,204

0,086

++

0,23

118

-

0,25

126

Примечание: Cпектр антител изучен с помощью диагностикума “Диагностические системы”

Здесь и в табл. 2, 3, 4

* значения реактивности сывороток к HCV в ИФА (ОП492)

** РНК HCV + (положительный результат), - (отрицательный результат).

*** АлАТ – аланинаминотрансфераза (мкмоль/л)

Жирный шрифт (положительный результат)

незаполненные графы – исследования не проводились.

Уровень ферментов был выше нормального в 1,5-2 раза. Морфологическое изучение изменений в биоптатах печени этой обезьяны было проведено только на 98 сутки, результат был отрицательным. РНК HCV, свидетельствующая об активной репликации вируса, была выявлена на 76-84 сутки (средний уровень вирусной нагрузки) и 87-114 сутки (низкий уровень вирусной нагрузки), в то время как на 52-70 сутки - отсутствовала (при выборочном исследовании сывороток).

Динамическое развитие спектра антител к HCV прослежено и на примере другой обезьяны - макака резуса № 31919, у которого наблюдалась примерно аналогичная закономерность в антителообразовании при наблюдении в течение 2,5 месяцев.

Результаты длительного динамического наблюдения за сывороточными и другими маркерами HCV- подобной инфекции у макак резусов представлены в табл. 2. Обследованию было подвергнуто 11 макак резусов. Длительность наблюдения варьировала от 6 до 55 месяцев (4,6 года), кратность обследования составила 2-6 раз.

У одной из обезьян (№32794) мы наблюдали развернутую картину сероконверсии. При первичном обследовании этой обезьяны анти-HCV не выявлялись. Спустя 7 месяцев у обезьяны были обнаружены анти-core и анти-NS3 (ОП492 составила 0,431 и 1,151 соответственно), при этом анти-NS4 и анти-NS5  не выявлялись. При обследовании этой обезьяны через 33 мес , мы уже не обнаружили анти-core, в то время как еще определялись довольно высокие значения анти-NS3 (ОП492 равнялась 1,080) и появились анти-NS4 и анти-NS5. Антитела к этим же белкам были зарегистрированы нами спустя два месяца, но с меньшей активностью. Спустя 49 и 55 месяцев после начала наблюдения обнаруживались только анти-NS5 (невысокие значения). Таким образом, обезьяна № 32794 была серопозитивной по крайней мере, в течение 48 мес. Кроме того, у этой обезьяны была обнаружена РНК HCV в пробах сывороток чрез 35 и 49 месяцев после начала наблюдения (на фоне присутствия антител к NS3+NS4+NS5 и NS5 соответственно). Следует отметить, что у большинства остальных макак резусов наблюдалось постепенное снижение активности регистрируемых анти-NS4, анти-NS3, анти-core и анти-NS5 (6-33 мес.).

Как видно из табл. 2, РНК HCV была обнаружена у макака резуса № 4006 на фоне присутствия только анти-NS4 (ОП492 составила 1,698) в первый срок обследования, а у обезьяны № 3004 – на фоне анти-core, анти-NS4 и анти-NS5 через 19 мес. после начала наблюдения.

Таблица 2.

Характеристика серологических и вирусологических маркеров HCV-инфекции у  макак резусов при длительном наблюдении.

П.П

№№ обезьян

№№ обезьян

Общий срок наблю-дения

(мес)

Крат ность обследо- вания

(мес)

антитела к HCV и его белкам 

РНК

HCV 

HCV 

Core

NS3

NS4

NS5

1.*

32794

55

1 (0)

0,194

2 (7)

1,670

0,431

1,151

0,067

0,091

3 (33)

0,452

0,172

1,080

0,910

0,674

4 (35)

0,380

0,216

0,458

0,420

0,672

+

5 (49)

1,047

0,044

0,112

0,131

0,517

+

6 (55)

0,437

0,186

0,133

0,251

0,763

2.*

32734

42

1 (0)

0,861

0,243

0,565

1,715

0,313

-

2 (8)

0,290

0,065

0,070

0,544

0,061

-

3 (22)

0,702

0,064

0,071

1,072

0,081

-

4 (42)

0,136

0,021

0,045

0,214

0,042

3.*

33406

42

1 (0)

0,879

0,094

0,119

1,698

0,126

+

2 (8)

0,427

0,106

0,152

0,823

0,075

-

3 (22)

0,133

0,089

0,063

0,416

0,137

-

4  (42)

0,038

4.**

30444

42

1 (0)

0,583

0,110

0,147

0,654

0,123

-

2 (8)

0,129

3 (22)

0,914

0,254

0,270

1,013

0,262

4 (42)

0,043

5.*

32777

33

1 (0)

0,632

0,501

0,717

0,987

0,064

-

2 (33)

0,557

0,646

0,464

0,772

0,616

6.**

3004

30

1 (0).

0.745

2 (19)

0.457

0.674

0.186

0.444

0,663

+

3 (21)

0.193

0.584

0.230

0.301

0,360

-

4 (30)

0.158

7.**

25584

24

1 (0)

0,421

0,747

0,305

0,141

0,319

2 (24)

0,452

0,630

0,534

0,462

0,564

-

8.**

32075

24

1 (0)

0,355

0,951

0,553

0,324

2 (24)

0,398

0,559

0,273

0,262

0,288

9.*

26083

13

1  (0)

1,253

0,154

0,182

1,709

0,379

2 (22)

1,227

0,099

0,062

1,392

0,261

-

10.**

31937

8

1 (0)

0,375

0,343

0,336

0,068

2 (8)

0,115

11.*

32273

6

1 (0)

0,368

0,076

0,077

1,297

0,085

2 (6)

0,303

0,100

0,160

0,950

0,103

Примечание: *- сыворотки исследованы диагностикумом «Диагностические  системы»,

Нижний Новгород.

**- сыворотки исследованы диагностикумом  «ГепаСкрин-тм» производства

«Вектор-БиАльгам», Новосибирск.

Также изучена динамика сывороточных маркеров HCV-инфекции у 5 макак яванских. Длительность наблюдения варьировала от 6 до 34 месяцев (2,8 года). Кратность обследования составила 2-4 раза. Практически у всех макак яванских в первый срок обследования были зарегистрированы только анти-core и анти-NS3 антитела с различной степенью активности. В последующие сроки обследования отмечалось постепенное снижение их уровня до минимального к 7-28 мес. наблюдения. Обращает внимание обезьяна № 30598, у которой анти-core сохранялись на протяжении 31 месяца наблюдения, причем характеризовались высокой реактивностью (ОП 492 варьировала от 2,808 до 1,323), в то время как анти-NS3 исчезли к 28 мес. наблюдения. У этой же обезьяны была выявлена РНК HCV как в первый срок обследования, так и спустя 28 мес. Анти-NS4 и анти-NS5 практически не определялись у макак яванских на протяжении всего срока наблюдения.

Таким образом, наблюдение за обезьянами, у которых первоначально были обнаружены антителами лишь к одному из белков HCV (в частности, анти-NS4 с низкой реактивностью), позволило в дальнейшем выявить не только положительную сероконверсию к нескольким белкам HCV, но и обнаружить РНК HCV, а также проследить повышение уровня АлАТ. Длительный мониторинг за серологическими и вирусологическими маркерами HCV у макак резусов и яванских позволил выявить у некоторых из них не только сохранение анти HCV (на протяжении 0,5-4 лет), но и персистенцию вируса. Вместе с тем, этот процесс, по-видимому, протекает практически бессимптомно, сопровождаясь лишь незначительным подъемом АлАТ. Морфологические изменения в печени не определялись.

По нашему мнению, течение естественной HCV-подобной инфекции макак резусов напоминает картину, которая отмечалась при экспериментальной HCV-инфекции у шимпанзе, являющейся наиболее адекватной моделью для этой инфекции [ 6 ].

Литература

  1. Гришаев  М.П., Поповский Ф.В., Пыринова Г.Б., Ястребова О.Н. Заметки с конференции "Гепатит С (Российский консенсус). // Информационный бюллетень. Новости "Вектор-Бест" – 2000. -  №4(18). - С. 6-7.
  2. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Чикобава М.Г. Естественное инфицирование приматов вирусом гепатита С. // Бюл. Экспер. Биол. – 2002. – .Т. 133, № 2. - С. 211-214.
  3. Кебурия В.В., Корзая Л.И., Лапин Б.А. Характеристика спектра антител к вирусу гепатита С у обезьян. // Там же. - С. 29. В кн.: "Сборник материалов научно-практической конференции "Медицина будущего", Краснодар-Сочи. - 2002. - С. 28-29.
  4. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Лазарева И.Я., Крылова Р.И. Вирусные гепатиты у лабораторных приматов. // В кн.: Перспективные направления использования приматов в медико-биологических исследованиях. Материалы Российской научной конференции (Сочи-Адлер, 8-10 августа 2006 г.). - С. 43-48.
  5. Кебурия В.В., Корзая Л.И. Характеристика HCV-подобной инфекции низших обезьян Старого Света. // Там же. - С. 79-84.
  6. Bassett S.E., Braske K.M., Lanford R.E. Analysis of hepatitis C virus-inoculated chimpanzees reveals unexpected clinical profiles.// J. Virol. - 1998. - Vol. 72. – N 4. - P. 2589-2599.  

Опубликована: В кн.: Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах. Материалы международной научной конференции. 19-22 сентября 2007 года, Сочи-Адлер. –  2007. - С. 132-141.

ДЛИТЕЛЬНОЕ ДИНАМИЧЕСКОЕ НАБЛЮДЕНИЕ ЗА HCV-ПОЗИТИВНЫМИ МАКАКАМИ АДЛЕРСКОГО ПРИМАТОЛОГИЧЕСКОГО ЦЕНТРА.

Кебурия В.В., Корзая Л.И, Крылова Р.И., Лапин Б.А.

РЕЗЮМЕ

Динамическому наблюдению было подвергнуто 18 серопозитивных по анти-HCV обезьян, в том числе 13 макак резусов (Macaca mulatta) и 5 макак яванских (M. fascicularis).

Наблюдение  за двумя макаками резусами, у которых первоначально были обнаружены антителами лишь к одному из белков HCV (в частности, анти-NS4 с низкой реактивностью), позволило в дальнейшем выявить не только положительную сероконверсию к нескольким белкам HCV, но и обнаружить РНК HCV, а также проследить повышение уровня АлАТ. Общий период наблюдения в данном случае составил 2,5 месяца.

Длительное (6-55 мес.) наблюдение за специфическими маркерами гепатита С у 16 макак резусов и яванских со спонтанной инфекцией позволило выявить у них анти-HCV на протяжении 0,5-4,5 лет. У одного из макак резусов нам удалось проследить развернутую картину сероконверсии к HCV на протяжении 55 мес. наблюдения. При первичном обследовании этой обезьяны анти-HCV не выявлялись. Спустя 7 мес. появились антитела к core и NS3 белкам. Через 33 мес. анти-core исчезли, но сохранялись еще высокие показатели анти-NS3, кроме того, в этот срок уже обнаруживались анти-NS4 и анти-NS5. Через 49 и 55 мес. выявлялись только анти-NS5 (невысокие значения). У большинства остальных макак резусов наблюдалось постепенное снижение активности первично зарегистрированных антител, в основном, анти-NS4, либо их в сочетании с анти-NS3, анти-core и анти-NS5 (8-43 мес).

У большинства макак яванских отмечалось постепенное снижение уровня первично обнаруженных нами анти-core и анти-NS3  вплоть до полного их исчезновения к 28-34 мес наблюдения. Следует также отметить, что РНК HCV обнаруживалась у некоторых обезьян в течение 14 - 28 мес. Антитела класса М повторно выявить не удалось.

Таким образом, длительный мониторинг за маркерами HCV у макак резусов и яванских позволил выявить у некоторых из них не только сохранение анти HCV (на протяжении 0,5-4,5 года), но и персистенцию вируса. Вместе с тем, этот процесс, по-видимому, протекает практически бессимптомно, сопровождаясь лишь незначительным подъемом АлАТ. Морфологические изменения в печени не определялись

По нашему мнению, течение естественной HCV-подобной инфекции макак резусов напоминает картину, которая отмечалась при экспериментальной HCV-инфекции у шимпанзе, являющейся наиболее адекватной моделью для этой инфекции.