Агумава А.А, Чикобава М.Г.,  Лапин Б.А. Разработка  ПЦР-тест системы для диагностики вирусов подсемейства Betaherpesvirinae приматов//Молекулярная генетика, микробиология, вирусология.- 2010.- №. 3.-С. 36–39.

Разработка  ПЦР-тест системы для диагностики вирусов подсемейства Betaherpesvirinae приматов.

А. А. Агумава, М. Г. Чикобава, Б. А. Лапин

Разработана ПЦР-тест система для определения вирусов Betaherpesvirinae приматов.  Путём сравнительного выравнивания полногеномных нуклеотидных последовательностей ЦМВ человека, шимпанзе и макаки резуса выявлены консервативные участки генов. Подобраны олигонуклеотиды-праймеры к консенсусной последовательности консервативного участка гена UL56 HCMV. В работе были подобраны условия проведения ПЦР,  и также  была показана специфичность праймеров к цитомегаловирусам разных видов обезьян.

Цитомегаловирус (ЦМВ) – представитель подсемейства Betaherpesvirinae, семейства Herpesviridae широко распространен в популяции приматов, а также других млекопитающих (свиней, морских свинок, крыс и т.д.)[3,10].

Данный вирус объединён в группу патогенов TORCH-комплекса (от лат. Toxoplasmosis, Others, Rubella, Chlamydiosis, Herpes) и представляет собой реальную угрозу плоду в случае внутриутробного заражения [4, 9].

У 5-15% инфицированных ЦМВ детей в дальнейшем наблюдаются различные нарушения, связанные главным образом с поражением головного мозга и слуха [1, 2].

ЦМВ связан также и с различными заболеваниями у взрослых. Так, цитомегаловирусная инфекция – частая причина осложнений и смерти у пациентов после трансплантации органов и больных СПИДом [3, 5, 7]. В последнее время, появились данные, что ЦМВ также играет определенную роль в индукции некоторых онкологических заболеваний, в частности рака толстой и прямой кишки [8].

Исследование ЦМВ инфекции обезьян (эпидемиологии, особенностей молекулярно- биологической структуры и филогенеза ЦМВ в отряде приматов), позволит предложить ЦМВ инфекцию обезьян как адекватную модель для изучения ЦМВ инфекции людей и в дальнейшем подойти к решению вопроса о профилактике и, возможно, разработке специфического лечения [10]. В настоящее время, молекулярно- биологические особенности ЦМВ отдельных видов приматов исследованы недостаточно.

Известные коммерческие ПЦР и ИФА тест- системы, разработанные для детекции ЦМВ человека, не пригодны для выявления ЦМВ приматов в связи с видовой специфичностью вируса.

Цель настоящей работы - разработать  универсальную тест систему для диагностики вирусов подсемейства Betaherpesvirinae приматов.

Для решения поставленной  задачи были использованы следующие подходы:

1. поиск и выбор консервативных участков генов в полногеномной консенсусной нуклеотидной последовательности Betaherpesvirinae разных видов приматов;

2. разработка праймеров к выбранной консервативной консенсусной нуклеотидной последовательности;

3. подбор условий проведения ПЦР.

Материалы и методы

Исследование проводили на базе Адлерского питомника обезьян Института Медицинской Приматологии РАМН.

Материалом для исследования послужили образцы крови и гомогенаты тканей слюнных желёз разных видов приматов:  60 макак резусов (Macaca mulatta), 50 макак яванских (Macaca fascicularis), 35 павиан гамадрил (Papio hamadryas), 15 павиан анубисов (Papio anubis), 24 зелёных мартышек  (Cercopitecus aetiops), 6 макак лапундер (Macaca nemestrina) и образцы крови 120 клинически здоровых людей (Homo sapience). Все обезьяны, как самцы, так и самки были в возрасте от 1 года до 10 лет и содержались в вольерах.

Сравнительный анализ и выравнивание нуклеотидных последовательностей были проведены с использованием пакета программ: BioEdit Sequense Alignment Editor (version 7.0.5.2 Copyright ©1997-2005), GeneStudio (TM) Professional Edition (version 1.03.72 1999-2004 GeneStudio Inc).

Подбор олигонуклеотидов- праймеров проводился с помощью программы Primer Premier (version 5.00).

Экстракция ДНК. Экстракцию ДНК из материалов проводили гуанидинтиоционатным методом (GuSCN). Материал (100 мкл крови, ткани слюнных желёз) переносили в пробирку содержащую 300 мкл 5М GuSCN, 1% тритон X- 100(v/v), 20 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl (pH 6,4), 10 мкл SiO₂, инкубировали 30 мин, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мл промывочного раствора, содержащего 5М GuSCN, 50мМ Tрис- HCl (pH 6,4) и двукратно 500 мл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис- HCl (pH 7.3), 50 мМ NaCl, 50% этиловый спирт. ДНК элюировали в 50 мкл 0.1 М Трис- ЕДТА (TE) буфера (pH 8,3) [6]. Для ПЦР амплификации использовали 5 мкл, остаток хранили при -20⁰С.

ПЦР анализ. Амплификацию проводили в 25 мкл раствора содержащего 50 мМ KCI, 10 мМ Tрис- HCI (pH 8,4), 3.0 мМ MgCl₂, 0,01% желатина, 100 нг каждого праймера, 0,2 мМ каждого  дНТФ и 2,5 единицы Taq ДНК полимеразы. Синтез праймеров был произведен в «Синтол» (г. Москва). В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из культуральной среды клеток фибробласта человека, заражённых лабораторным штаммом AD169 цитомегаловируса человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная вода. ПЦР проводили на аппарате «Терцик» («ДНК-технология», Москва).

Продукты ПЦР анализировали электрофоретически в 2% агарозном геле с 0.5 мкг/мл этидиум бромида. Электрофорез проводили 15 мин., при 50А, 10 V/см. Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе при длине волны УФ 330нм. О положительной реакции судили по полосе ампликона, соответствующей размеру 200 п.о.

Секвенирование нуклеотидных последовательностей  проводили на автоматическом секвенаторе «ABI Prism 3100» («Applied Biosystems», США) в ЗАО «Постгеномные и нанотехнологические инновации», г. Москва.

Результаты и обсуждение

Используя базу данных GenBank, был произведён поиск известных полногеномных нуклеотидных последовательностей цитомегаловируса человека и обезьян разных видов. Для анализа были выбраны последовательности, указанные в табл.1.

Таблица 1Последовательности ДНК ЦМВ использованные для поиска консервативных участков генов.

Мы исходили из предположения, что сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей позволит нам выявить консервативные фрагменты ДНК, специфичные для всего подсемейства Betaherpesvirinae. Анализ проводили в два этапа. На первом этапе провели сравнение всех полногеномных последовательностей ЦМВ человека и получили консенсусную последовательность (HCMV consensus). На втором этапе провели сравнительное выравнивание HCMV consensus с полногеномными последовательностями ЦМВ шимпанзе (PoHV-4) и макаки резус (RhCMV и CeHV-8). Проценты гомологии представлены в табл. 2.

Таблица 2 Гомология полногеномных сиквенсов ЦМВ разных видов приматов

Как следует из таблицы, процент гомологии среди ЦМВ разных видов достаточно низок, что указывает на вероятно древнее происхождение вируса и раннюю эволюционную дивергенцию ЦМВ в отряде приматов, а также объясняет видовую специфичность вируса.  

Выравнивание полногеномных сиквенсов ЦМВ шимпанзе (AF480884) и макаки резуса (AY186194 и DQ120516) с консенсусной последовательностью HCMV consensus позволило выбрать максимально гомологичные участки нуклеотидных последовательностей. В результате поиска консервативных регионов по всей длине консенсусной последовательности  было найдено  несколько участков с 100% гомологией.

Анализ показал, что для подбора праймеров подходит фрагмент гена UL56, кодирующий ДНК-связывающий белок, который играет ключевую роль в упаковке вирусной ДНК [11]. Данный фрагмент гена содержит самые длинные гомологичные участки и является наиболее консервативным не только среди подсемейства Alphaherpesvirinae [5], но и в подсемействе Betaherpesvirinae. Данный факт позволил предположить, что указанный участок должен быть консервативным для всех, в том числе еще не изученных ЦМВ приматов. Результаты проведенного сравнительного выравнивания  нуклеотидных последовательностей участка гена UL56 ЦМВ приматов представлены на рис.1. 

Рис.1. Сравнительное выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагмента гена UL56 ЦМВ приматов.

Примечание: подчёркнуты позиции праймеров. 

С помощью программы Primer Premier (version 5.00) были подобраны праймеры к данному региону. Поиск был проведен по следующему алгоритму: длина праймеров 20±2, длина ампликона 200-500 пар оснований (п.о.). В результате поиска в последовательности гена UL56 указанным характеристикам соответствовало несколько олигонуклеотидных сиквенсов. Однако дальнейший анализ олигонуклеотидов на образование шпилек, димеров, кросс-димеров и ложный отжиг, выявил наиболее стабильную пару праймеров следующей последовательности - левый праймер: 5’-ctc cac gtc ctc ccc gta- 3’; правый праймер: 5’-agg cgc tga ggg ata caa c- 3’; амплифицирующих участок длиной  200 п.о. Проверка последовательности праймеров на их специфичность через BLAST показала 100 гомологию только к гену UL56 цитомегаловирусов приматов. Локализация праймеров представлена на рис.1.

Оптимизацию ПЦР проводили по следующим параметрам: температуру отжига меняли от 61⁰С до 67⁰С с шагом в 1⁰С; концентрацию ионов магния - от 2,0 мМ до 3,5 мМ с шагом 0,5 мМ. Элетрофореграммы продуктов ПЦР представлены  на рис.2. 

Рис. 2. Элетрофореграмма продуктов ПЦР с использованием положительного контроля

М – маркёр молекулярного веса, ДНК фага лямбда/HindIII; К- – отрицательный контроль; 1-28 положительный контроль; 1-4 температура отжига – 61⁰С; 5-8 – 62⁰С; 9-12 – 63⁰С; ; 13-16 – 64⁰С; ; 17-20 – 65⁰С; 21-24 – 66⁰С; 25-28 – 67⁰С; 1,5,9,13,17,21,25 - концентрация ионов магния – 2,0 мМ; 2,6,10,14,18,22,26 – 2,5 мМ; 3,7,11,15,19,23,27 – 3,0 мМ; 4,8,12,16,20,24,28 – 3,5 мМ.

В процессе оптимизации ПЦР было показано, что система работает в широком температурном режиме и концентрациях ионов Mg²⁺.

Чтобы уменьшить возможность неспецифического связывания праймеров с ДНК мишенью, были выбраны следующие условия проведения ПЦР: концентрация Mg²⁺ 3,0 mM, температурный режим 95⁰С - 2 мин; далее 5 циклов: 95⁰С - 50 с, 64⁰С - 50 с, 72⁰С - 50с; далее 40 циклов: 95⁰С - 40с, 62⁰С – 35с,  72⁰С – 35с;  хранение 10⁰С.

Для проверки возможности данной ПЦР-тест системы выявлять ЦМВ разных видов приматов, были отобраны 190 образцов ДНК, выделенных из крови и слюнных желёз приматов следующих видов: M. mulatta, M. fascicularis, P. hamadryas, P. anubis, C. aetiops, M. nemestrina, а также 120 образцов ДНК, выделенных из крови людей.  Результаты амплификации отдельных образцов ДНК разных видов приматов представлены на рис.3. 

Рис.3. Электрофореграммы рандомного скрининга на ЦМВ образцов ДНК, выделенных от разных видов приматов

М – маркёр молекулярного веса, ДНК фага лямбда/HindIII; К-  – отрицательный контроль; К+ – положительный контроль; 1-3 – M. nemestrina; 4-8 – C. aetiops; 9-13 – P. hamadryas; 14-17 – M. fascicularis; 18-22 – M. mulatta; 23-25 – P. anubis; 26-30 – H. sapience.

Как видно на фотографии положительные образцы на ЦМВ обнаруживаются у разных видов приматов: M. nemestrina: №2; C. aetiops: №4,№5,№7,№8; P. hamadryas: №9, №10, №11, №12; M. fascicularis: №14, №15, №17; M. mulatta: №19, №20, №22; P. anubis: №24, №25; H. sapience: №28, №29, №30.

Для подтверждения положительных результатов ПЦР было проведено секвенирование полученных ампликонов. Анализ сиквенсов обнаружил 98% гомологию с фрагментом гена UL56 Betaherpesvirinae разных видов приматов. Таким образом, разработанная нами тест- система позволяет выявлять ЦМВ разных видов приматов и может быть рекомендована для дальнейшего использования.

ЛИТЕРАТУРА 

1. Alford C. A., Hayes K., Britt W. J. // Infect Dis. – 1988. – Vol. 158, N 5. – P. 917-924.
2. Britt W. J., Pass R. F., Stagno S., Alford C. A. // Rev. Infect. Dis. – 1990. – Vol. 12, N 7. – P.  745–753.
3. Bruggeman C. A., Virchows A. B.  // Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. – 1993. – Vol. 64, N 6. – P. 325–333.
4. Cao Y., Qiu L., Zhang Q. // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. – 1999. – Vol. 34, N 9. – P. 517–520.
5. Grattan M. T., Moreno-Cabral C. E., Starnes V. A. et al. // J. Virol. – 2008. – Vol. 82, N 11. – P. 5220–5233.
6. Harwood A. J. // Methods Mol. Biol. – 1996. – Vol. 58, – P. v-vi.
7. McKenzie R., Travis W. D., Dolan S. A., Pittaluga S. et. al. // Medicine (Baltimore). – 1991. – Vol. 70, N 5. – P. 326–343.
8. Michaelis M., Doerr H. W., Cinatl J. // Neoplasia. – 2009. – Vol. 11, N1. – P. 1–9.
9. Mladina N., Mehikić G., Pasić A. // Med Arh. – 2000. – Vol. 54, N 5-6. – P. 273-276.
10. Powers C., Früh K. // Med. Microbiol. Immunol. – 2008. – Vol. 197, N 2. – P. 109-115.
11. Ushijima Y., Koshizuka T., Goshima F., et. al.  // J. Virol. – 2008. – Vol. 82, N 11. – P. 5220-5233.

DEVELOPMENT OF PCR-TEST SYSTEM FOR DETECTION PRIMATES BETAHERPESVIRINAE

A. A. Agumava, M. G. Chikobava, B. A. Lapin

A PCR-test system for detection of primate Betaherpesvirinae viruses was developed. By alignment of complete genome of human, chimpanzee and macaca rhesus cytomegalovirus conserve regions of viral gens were found. The oligonucleotide primers for consensus conserve regions of CMV UL56 gene were developed. The conditions of PCR were optimized and primers specificity for cytomegaloviruses of different primate species was confirmed.