07 | 08 | 2020

Агумава А.А., Чикобава М.Г., Лапин Б.А. Лабораторная диагностика цитомегаловируса у людей и обезьян Адлерского питомника//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2010.-т.149.-№5

Лабораторная диагностика цитомегаловируса у людей и обезьян Адлерского питомника.

А. А. Агумава, М. Г. Чикобава, Б. А. Лапин

Проведён мониторинг маркёров цитомегаловируса (ЦМВ) в крови людей, а так же в крови, смывах из зева и тканях слюнных желёз обезьян разных видов Адлерского питомника. Показана корреляция процента инфицирования ЦМВ с возрастом у людей. Обнаружено, что с максимальной частотой вирус обнаруживается в тканях слюнных желёз, а с минимальной – в крови.

Ключевые слова: цитомегаловирус, обезьяны, кровь, слюнные железы

Цитомегаловирус (ЦМВ) - это ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Herpesviridae, род Cytomegalovirus [4,10]. Цитомегаловирусная инфекция широко распространена и характеризуется многообразными проявлениями - от бессимптомного течения до тяжелых генерализованных форм с поражением внутренних органов и центральной нервной системы [1,9]. Отличительными особенностями ЦМВ является широкий спектр путей инфицирования: воздушно-капельный, урогенитальный, внутриутробный, постнатальный, а также через компоненты крови при переливаниях и пересадке органов. ЦМВ может инфицировать различные органы и ткани, включая клетки нервной ткани, костного мозга, лимфоузлов, печени, легких, ЖКТ, гениталий, клеток крови. Первичное инфицирование может переходить в латентную стадию инфекции с последующей возможной реактивацией при состояниях, связанных с иммунной супрессией [6,8,11].

Наряду с вирусом цитомегалии человека известны цитомегаловирусы обезьян, морских свинок, крыс, мышей и т.д., патогенные только для своего вида [2,3,5,10]. Сравнительное исследование ЦМВ обезьян и людей позволит понять особенности инфекции, что в дальнейшем поможет подойти к решению вопроса о профилактике и разработке специфического лечения. В настоящее время лабораторная диагностика ЦМВ отдельных видов приматов исследована не достаточно.

Целью настоящего исследования явилось лабораторная диагностика ЦМВ у людей и обезьян, определение частоты обнаружения вируса в разном биологическом материале, а также выявление эффективности  методов ИФА и ПЦР. 

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проводили на базе Адлерского питомника обезьян Института Медицинской Приматологии РАМН. Материалом для исследования послужили 176 образцов крови, 68 соскобов из глотки и 86 образцов тканей слюнных желёз обезьян разных видов, а так же образцы крови 120 клинически здоровых людей. Кровь, смывы из зева и ткани слюнных желёз были взяты от разных животных. Биологический материал, собранный от обезьян разных видов был разделён на 3 группы:

1. Образцы крови 50 макак резус (Macaca mulatta), 38 макак яванских (Macaca fascicularis), 30 павиан гамадрил (Papio hamadryas), 20 павиан анубис (Papio anubis), 30 зелёных мартышек  (Cercopitecus aehtiops), 8 макак лапундер (Macaca nemestrina);

2. Смывы из зева 20 макак резус, 12 макак яванских, 13 павиан гамадрил, 6 павиан анубис, 14 зелёных мартышек, 3 макак лапундер;

3. Ткани слюнных желёз 25 макак резус, 15 макак яванских, 20 павиан гамадрил, 8 павиан анубис, 14 зелёных мартышек, 4 макак лапундер.

Экстракцию ДНК из материалов проводили двумя методами: гуанидинтиоционатным методом (GuSCN) - для экстракции ДНК из крови и смывов из зева и протеиназным методом (с использованием фермента протеиназы – К) для экстракции ДНК из тканей слюнных желёз.

При гуанидинтиоционатном методе материал (100 мкл крови, смыва из зева) переносили в пробирку, содержащую 300 мкл 5М GuSCN, 1% тритон X-100(v/v), 20 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCl (pH 6.4), 10 мкл SiO2, инкубировали 30 мин, центрифугировали и отмывали осадок однократно 500 мл промывочного раствора, содержащего 5М GuSCN, 50мМ Tрис-HCl (pH 6.4) и двукратно 500 мл промывочного раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl (pH 7.3), 50 мМ NaCl, 50% этиловый спирт. ДНК элюировали в 50мкл 0.1 М Трис-ЭДТА (TE) буфера (pH8.3) [7]. 

При протеиназном методе материал (100 – 200 мг ткани слюнных желёз) переносили в пробирку, с 1 мл раствора, содержащего 2.5 мМ MgCl2, 20 мкг протеиназы-К (30 еа/мг), инкубировали 24 часа при 540С, инактивировали протеиназу нагреванием до 950С 5 мин, центрифугировали 3 мин при 13000 об/мин, надосадочную жидкость переносили в отдельные пробирки [7]. Для ПЦР амплификации использовали 5 мкл, остаток хранили при -200С.

Амплификацию проводили в 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ KCI, 10 мМ Tрис- HCI (pH 8.4), 3.0 мМ MgCl2, 0,01% желатина, 100нг каждого праймера, 0,2 мМ каждого  дНТФ и 2.5 единицы Taq ДНК полимеразы. Синтез праймеров был произведен в «Синтол» (г. Москва). В качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из культуральной среды клеток фибробласта человека, заражённых лабораторным штаммом AD169 цитомегаловируса человека. Отрицательным контролем служила дистиллированная вода. ПЦР проводили на аппарате «Терцик» («ДНК-технология», Москва).

После амплификации материал вносили  в 2% агарозный гель, содержащий 0.5 мкг/мл этидиум бромида. Электрофорез проводили 15 мин., 50А, 10 V/см. Продукты амплификации визуализировали на трансиллюминаторе при длине волны УФ 330 нм.

В качестве материала для исследования при проведении ИФА использовали сыворотку крови. полученную из цельной крови людей и обезьян разных видов. Для постановки ИФА использовали коммерческую тест систему для определения IgG человека к ЦМВ, фирмы «Вектор Бест» (Новосибирск, Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При постановке иммуноферментного анализа мы определяли реактивность антител класса G (IgG) к цитомегаловирусу. Представлены данные по обследованию 137 клинически здоровых людей (табл. 1). Общий процент серопозитивных по ЦМВ составляет 91%. Также прослеживается корреляция между возрастом и процентом положительных на антитела к ЦМВ людей.

Таблица 1. Определение антител к ЦМВ в сыворотке клинически здоровых людей

Возраст

Количество обследованных

Серопозитивных

Процент серопозитивных

До 25 лет

13

8

61%

От 25 до 40

40

35

87%

От 40 до 55

38

36

95%

От 55  и выше

46

46

100%

итого

137

124

91%

Так же было проведено ИФА тестирование на наличие антител к ЦМВ у клинически здоровых обезьян разных видов (табл.2).

Таблица 2. Определение антител к ЦМВ в сыворотке клинически здоровых обезьян разных видов

Вид

Количество обследованных

Серопозитивных

Процент серопозитивных

макаки резус

50

15

30%

макаки яванские

38

12

32%

павианы гамадрил

30

10

33%

павианы анубис

20

5

25%

зелёные мартышки

30

11

37%

макаки лапундер

8

2

25%

итого

176

55

31%

Как видно из таблицы, в процентном отношении обнаружение IgG к ЦМВ у обезьян колеблется от 25 до 37%, что в 3 раза меньше таковых показателей у людей.

В данном исследовании было проведено ПЦР–тестирование, направленное на качественную детекцию вируса в разном биологическом материале. Для проведения ПЦР были подобранны праймеры к общему консервативному участку гена UL56 цитомегаловирусов человека и обезьян. По результатам ПЦР-тестирования образцов крови клинически здоровых людей и обезьян разных видов видно, что процент вирусемии как у людей, так и у обезьян достаточно низок и составляет 0-5%. (табл.3).

Таблица 3. Результат ПЦР тестирования образцов крови клинически здоровых людей и обезьян разных видов на наличие ЦМВ

Вид

Общее количество обследованных

Положительные на ЦМВ

Процент положительных

на ЦМВ

Люди

137

6

4%

Макаки резус

50

2

4%

Павианы гамадрил

30

1

3%

Макаки яванские

38

2

5%

Зелёные мартышки

30

1

3%

Павианы анубис

20

1

5%

Макаки лапундер

8

-

0%

При использовании в качестве вирусологического материала смывов из зева наблюдалась другая картина по частоте выявления (табл. 4).

Таблица 4. Результат ПЦР тестирования смывов из зева клинически здоровых обезьян разных видов на наличие ЦМВ

Вид

Общее количество обследованных

Положительные на ЦМВ

Процент положительных

на ЦМВ

Макаки резус

20

3

15%

Павианы гамадрил

13

2

15,3%

Макаки яванские

12

2

16%

Зелёные мартышки

14

3

21%

Павианы анубис

6

1

17%

Макаки лапундер

3

-

0%

ВСЕГО

68

11

16%

Как видно из таблицы, общий процент ЦМВ положительных составляет 16%, что в 4 раза больше, чем результаты тестирования образцов крови. Это обусловливается тем, что клетки эпителия могут быть латентно инфицированы данным вирусом.

В качестве заключительного тестирования проводилась детекция ЦМВ в тканях слюнных желез обезьян разных видов (табл.5). Материал был взят на аутопсиях.

Таблица 5. Результат ПЦР - тестирования образцов слюнных желёз обезьян разных видов взятых  на аутопсии

Вид

Общее количество обследованных

Положительные на ЦМВ

Отрицательные на ЦМВ

Процент положительных

на ЦМВ

Макаки резус

25

16

9

64%

Павианы гамадрил

20

13

7

65%

Макаки яванские

15

9

6

60%

Зелёные мартышки

14

10

4

71%

Павианы анубис

8

4

4

50%

Макаки лапундер

4

2

2

50%

ВСЕГО

86

54

32

63%

Довольно низкий процент ЦМВ выявляется методом ПЦР из крови как у обезьян, так и у людей, несмотря на то, что антитела к вирусу имеются у 25-91%. Данный факт свидетельствует, что вирусная нагрузка при ЦМВ носительстве настолько мала, что не выявляется однораундовой полимеразно-цепной реакцией.

В  смывах из зева процент выявления вируса в 2-3 раза выше, чем в крови и составляет 15 – 21%. Это свидетельствует о латентной инфицированности эпителиальных клеток зева вирусом.

Самый высокий процент выявления вируса в тканях слюнных желез, инфицированность которых составляет 50 – 70%.  Данный факт объясняется тропностью ЦМВ к тканям слюнных желез и персистенцией в клетках в латентной форме.

Относительно заниженные проценты ЦМВ положительных на антитела обезьян по сравнению с таковыми показателями у людей обусловлены, по всей видимости, межвидовой специфичностью антител класса G, а также различием цитомегаловирусов человека и обезьян по антигенной структуре. Как следствие этого человеческая ИФА тест система не может быть использована для полноценной диагностики антител к ЦМВ у обезьян.

Таким образом, мониторинг ЦМВ маркёров показал высокий процент инфицированности при маленькой вирусной нагрузке, что характерно для латентной инфекции.

ЛИТЕРАТУРА 

1. Ajit P.L., Kirby K.A., Rubenfeld G.D., Leisenring W.M., Bulger E.M. et al. // JAMA. 2008. Vol. 300, N 4. P. 413-422.

2. Bahr U., Darai G. // Journal of Virology. 2001. Vol. 75, N 10. P. 4854–4870.

3. Johnson G., Dick D., Ayers M., Petric M., Tellier R. // Journal of Clinical Microbiology. 2003. Vol. 41, N 3. P. 1256–1258.

4. Johnson G., Nelson S., Petric M., Tellier R. // Journal of Clinical Microbiology. 2000. Vol. 38, N 9. P. 3274–3279.

5. Michaels M.G., Jenkins F.J., George K.S., Nalesnik M.A., Starzl T.E., Rinaldo C.R. // Journal of Virology. 2001. Vol. 75, N 6. P. 2825–2828.

6. Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D. // Journal of Clinical Microbiology. 2005. Vol. 43, N 9. P. 4713–4718.

7. Powers C., Früh K. // Med Microbiol Immunol. 2008. Vol.197, N 2. P. 109-15.

8. Revello M.G., Gerna G. // Clinical Microbiology Reviews. 2002. Vol. 15, N 4. P. 680-715.

9. Sinclair J., Sissons P. // J Gen Virol. 2006. Vol. 87, N 7. P. 1763-79.

10. Staczek J. // Microbiological Reviews. 1990. Vol. 54, N 3. P. 247-265.

11. Wiener-Well Y., Yinnon A.M., Singer P., Hersch M. // Isr Med Assoc J. 2006. Vol. 8, N 8. P. 583-4.

Laboratory diagnostics of cytomegalovirus in humans and non-human primates of the Adler monkey colony.

A. A. Agumava, M. G. Chikobava, B. A. Lapin

Monitoring of cytomegalovirus (CMV) markers in people’s blood, and in blood, washouts from a pharynx and salivary glands tissue in different species of monkeys of the Adler monkey colony were carried out. Correlation between percent of CMV infection in people and their age has been shown. The virus was detected with the maximum frequency in the tissue of salivary glands, and with minimum – in blood.