07 | 08 | 2020
TXT_1 Полные тексты докладов
8-10 АВГУСТА, СОЧИ, РОССИЯ AUGUST 8-10, 2011, SOCHI, RUSSIA СОДЕРЖАНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ПРИМАТАХ Б.А.Лапин Вступительное слово Б.Мортон «Использование низших приматов в исследованиях, проводимых в США» С.Треуе, К.Принз, Б.Паулинг, Р.Теепе «Сеть приматологических центров: гарантия лучшей практики и улучшение 3Р (повышение качества, уменьшение числа, замещение на другие виды) в исследованиях на приматах» Д.Кемнитц «Международный приматологический план: Предложение по глобальной совместной инициативе» З.Я.Миквабия, В.З.Агрба, Э.П.Фридман «Становление и развитие в Абхазии медико-биологических исследований на приматах (история, люди, события, факты)» Э.П.Фридман «Исторический путь медицинской приматологии» А.И.Григорьев, И.Б.Козловская, А.М.Бадаква «Физиологические исследования на обезьянах: настоящее и будущее» Н.П.Гончаров, Г.В.Кация «Низшие обезьяны как экспериментальная модель для изучения эндокринной системы человека» «ИСПЫТАНИЕ НА ПРИМАТАХ ЭФФЕКТИВНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ» Й.Кун «Геморрагическая лихорадка обезьян как модель человеческой геморрагической лихорадки, выполняемая в условиях 2 уровня биобезопасности» Д.Боуден «Нейрокарты: Web-ресурс, позволяющий обрабатывать изображения при изучении патоморфологии мозга макак» И.Н.Лаврентьева «Разработка и доклинические испытания вакцины против краснухи на основе штамма «Орлов» Б.А.Лапин, В.Ю.Давыдкин, Э.К.Джикидзе, А.В.Мелихова, Т.И.Кебу, И.Ю. Давыдкин, Л.И.Холодилова, С.Н. Ардашелия «Оценка терапевтической эффективности биопрепаратов в капсулах в доклинических испытаниях на обезьянах» Ф.И.Ершов «Использование отечественных противовирусных препаратов для профилактики и терапии болезней обезьян» Е.А.Романовская-Романько, B.Ferko, О.И.Вышемирский, Ю.Р.Романова, М.П.Грудинин, Б.А.Лапин, А.Ю.Егоров, О.И.Киселев «Оценка безопасности и иммуногенности вакцины с удаленной NS1открытой рамкой считывания на модели яванских макак (Macaca fascicularis)» Л.И.Новикова, В.А.Алешкин, М.М.Зуева, А.В.Волков, И.В.Борисова, И.М. Аршба, О.И.Вышемирский, Э.К.Джикидзе, И.И.Чугуева «Использование приматов для испытания интраназальной лекарственной формы комплексного иммуноглобулинового препарата» Э.Г. Деева, Т.И.Мельникова, Т.Г.Лобова, В.Л.Русинов, О.И.Киселев «Новый противовирусный препарат – триазавирин. От доклинического изучения к клинической практике» ФИЗИОЛОГИЯ, КОСМИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА, РАДИОЛОГИЯ И ЭНДОКРИНОЛОГИЯ Н.Д.Гончарова, В.Ю.Маренин, А.А.Венгерин, Т.Э.Оганян, Б.А.Лапин «Старение гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы у лабораторных приматов с депрессивноподобным и агрессивным поведением» В.Н. Анисимов «Световой режим, мелатонин и рак» Н.Э.Ордян, Н.Д.Гончарова, С.Г.Пивина, С.А.Смелкова «Новые подходы к фармакокоррекции гормональных нарушений в женском организме на разных этапах онтогенеза: экспериментальное исследование на животных» А.Г.Виноходова, М.М.Хананашвили, К.Н.Еськов, «Опыт исследования группового поведения при наземном моделировании пилотируемого полета к Марсу» Л.А.Яковлева, Э.К.Джикидзе «Имитация на обезьянах лучевой патологии, возможной при межпланетных полетах человека (ретроспективный анализ)» Д. Кемнитц «Ограничение калорийности питания и старение макак резус. Исследование в Университете Висконсин» А.А.Венгерин, Т.Э.Оганян, Н.Д.Гончарова «Влияние пептидного препарата эпиталона на эндокринную функцию поджелудочной железы самок макак резусов разных возрасных групп» В.Ю.Маренин, Н.Д.Гончарова, А.В.Шмалий, А.А.Венгерин «Активность эритроцитарной глутатионредуктазы у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения» В.Н.Фоменко, Н.Э.Хашиг, В.С.Баркая, Л.О.Ахуба, А.А.Алексян, Р.Р.Джикирба, Ж.Д.Сабекия, Л.И.Джелиев «Характеристика биохимических показателей крови павианов гамадрилов и макак резусов сухумского питомника в сравнительно-возрастном аспекте» Т.Е.Гвоздик, Б.А.Лапин, И.Н.Клоц «Колебания в уровнях глюкозы у нормальных и стрессированных макаков резус» ИНФЕКЦИОННАЯ ПАТОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ И ОНКОЛОГИЯ Ф.Л.Киселев «Молекулярная онкология: прошлое, настоящее, будущее» Д.Петриссиани «Разработка на обезьянах теста на потенциальную злокачественность и клеточные линии для производства вакцин» И.А.Букаева, Н.Т.Райхлин, М.В.Пономарёва, Е.А.Смирнова, А.К.Чекини, А.И.Павловская, М.А.Шабанов «В23/нуклеофозмин и С23/нуклеолин – маркеры темпа роста и степени злокачественности карциноидных опухолей легкого» Р.М.Салимов, Ю.А.Федотов, О.В.Дорожко, Е.В.Шипаева, А.А.Леонов, Р.В. Иванов «Изучение хронической токсичности соединения IN-10, обладающего противоопухолевой активностью, на яванских макаках» В.Т.Манчук, О.В.Смирнова «Острый лимфобластный лейкоз: особенности функционирования лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов» К.К.Кюрегян, В.Ф.Полещук, М.И.Михайлов «Моделирование вирусных гепатитов на ингрунковых обезьянах» О.И.Киселев «Эволюционная роль ретровирусов, функции плаценты и механизмы иммуносупрессии при беременности» М.В.Лахтин, А.Л.Байракова, В.М.Лахтин, А.В.Алешкин, С.С.Афанасьев, В.А. Алешкин «Микробиоценозная модель «патоген – пробиотические лектины» для мониторинга бисбиоза биотопов приматов» В.А.Калашникова «Helicobacter Pylori у обезьян: генетические особенности микроорганизмов» Б.А.Лапин, М.Г.Чикобава «Поиск последовательностей SV-40 в опухолях человека» М.В.Мезенцева, В.З.Агрба, С.Е.Постнов, И.М.Шаповал, Н.А.Афанасьев, Л.И.Руссу, А.А.Агумава, Б.А.Лапин «Особенности экспрессии генов регуляторных цитокинов у обезьян – носителей SV-40» З.В.Шевцова, Д.Т.Кубрава, А.Ю.Медкова, Л.Н.Синяшина, И.Г.Конджария, А.З.Матуа, Ж.В.Елистратова, Г.И.Каратаев, З.Я.Миквабия «Обезьяны как модель для изучения персистенции и иммунного ответа при интраназальном введении природных и искусственно аттенуированных бактерий Bordetella pertussis» Л.И.Корзая, В.В.Кебурия, А.М.Гончаренко, Д.И.Догадов, Б.А.Лапин «Маркеры вирусных инфекций у лабораторных приматов» Г.Я.Каган , Э.К.Джикидзе, И.В.Раковская «Результаты изучения патогенности L-форм стафилококка для обезьян» Л.Г.Горина, И.М.Аршба, С.А.Гончарова, Э.К.Джикидзе «Выявление антигенов микоплазм в крови обезьян адлерского питомника» Р.Я.Подчерняева, Е.И.Исаева «Репродукция РНК- и ДНК-содержащих вирусов в культуре клеток Vero» В.В.Тимановская, Е.Р.Вольтер, Э.Ф.Киласония, З.Я.Миквабия, Е.Н.Саджая, К.Ш.Тарба «Испытание противоопухолевого действия активной (нанодисперсной) двуокиси марганца на кроличьей модели злокачественной лимфомы, индуцированной онкогенными вирусами обезьян M. Arctoides» И.М.Аршба, В.В.Слободенюк, С.С.Афанасьев, Э.К.Джикидзе «Распространение и роль хламидий в спонтанной патологии обезьян» В.А.Науменко, Ю.А.Тюленев, Р.Р.Климова, Д.Ю.Пушкарь, А.С.Сегал, С.В.Альховский, А.А.Кущ «Моделирование герпесвирусной и цитомегаловирусной инфекции мужских гамет In Vitro» И.Е.Игнатова, В.З.Агрба, И.А.Гварамия, М.С.Кутовой «Состояние клеточного и гуморального иммунитета у макак резус, подвергшихся ионизирующему облучению» Т.П. Егорова, Т.И.Кебу «Некоторые данные о кишечных паразитарно-бактериальных ассоциациях у обезьян адлерского питомника» О.А.Дмитренко, В.А.Калашникова, З.К.Стасилевич, Э.К.Джикидзе «Анализ генетического бэкграунда штаммов Staphylococcus Aureus, изолированных от обезьян» В.А.Калашникова, Н.А.Захарова «Использование современных методов исследования в диагностике Helicobacter pylori -ассоциированной инфекции у обезьян и людей» Р.А.Хамитов, И.В.Борисевич, М.Ф.Хамитова «Использование макак яванских в качестве экспериментальной модели для изучения вируса гриппа птиц» З.К.Стасилевич, Э.К.Джикидзе, В.А.Калашникова, Т.И.Кебу, О.А.Султанова «Анаэробная кишечная микрофлора обезьян» Д.Д.Карал-оглы, В.З.Агрба, И.Е.Игнатова, И.А.Гварамия, М.С.Кутовой «Иммунный статус обезьян, наиболее часто используемых в медико-биологических исследованиях» З.В.Шевцова, А.З.Матуа, С.Л.Палба, А.А.Амичба, В.С.Баркая, Ж.В.Елистратова, Н.Э.Хашиг «Сравнительный анализ показателей врожденного и адаптивного иммунитета макак резусов и людей» НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ИССЛЕДОВАНИЯХ НА ПРИМАТАХ У.Мартин «Плюрипотентные стволовые клетки обезьян для применения в регенеративной терапии» Д.Вандеберг «Модель на павианах в исследованиях стволовых клеток в восстановительной медицине» А.Г.Коноплянников, В.З.Агрба, С.Ш.Кальсина, Е.В.Агаева, М.А. Коноплянников, Л.В.Курсова, О.А.Коноплянникова, В.Н.Петров «Мезенхимальные стволовые клетки как ключевой элемент физиологической регенерации и «аварийной» репарации целостного организма» В.З.Агрба, Б.А.Лапин, В.А.Порханов, Л.А.Яковлева, А.Г.Коноплянников, В.В.Тимановская, Т.Е.Гвоздик, С.Ш.Кальсина, Д.Д.Карал-оглы, А.А. Агумава, Ю.П.Чугуев, А.В.Леонтюк, И.А.Гварамия, И.Е.Игнатова «Культуры лимфоидных и стволовых клеток приматов и их использование в медико-биологических исследованиях» А.И.Алёхин, Т.В.Сергеева, В.И.Шастак, И.А.Казанцева, В.В.Базаева, В.В.Васильев, О.П.Богатырев, В.С.Баркая, А.В.Луковкин «Применение в эксперименте лазерного воздействия с использованием фотосенсибилизатора при злокачественной лимфоме» Г.Хунсман «Определение направленности антител с помощью пептидных микронаборов» А.И.Арчаков «От проекта «Геном человека» к проекту «Протеом человека» В.Х.Хавинсон, С.В.Трофимова, Н.С.Линькова, А.В.Дудков «Трипептид регулирует пролиферацию и дифференцировку эмбриональных клеток тимуса» Б.Фергюсон «Генетический анализ полиморфизма единичных нуклеотидов позволяет установить страну происхождения макак резусов и яванских макак» Н.Г.Кокая, А.А.Кокая, И.В.Мухина «Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на отдаленные адаптационные структурные перестройки в ткани поджелудочной железы у крыс с острой инсулиновой недостаточностью» ПОВЕДЕНИЕ В.Г.Чалян, Н.В.Мейшвили «Разведение обезьян в Адлерском питомнике» С.Н.Поулли «Управление поведением макак яванских и использование методов ознакомления и положительного усиления для улучшения жизни животных и облегчения проведения исследований » С.В.Васильев «Эволюция коммуникативной системы приматов в связи с проблемой происхождения речи» С.Б.Боруцкая «Локомоторное поведение приматов и проблема происхождения бипедии гоминид» З.А.Зорина «Когнитивные способности приматов» М.Л. Бутовская «К вопросу о дифференцированном репродуктивном успехе в эгалитарных обществах охотников-собирателей: хадза Танзании» Н.В.Мейшвили, В.Г.Чалян, Я.Ю.Рожкова «Влияние условий содержания на вероятность проявления анормального поведения у самок макак резусов» Я.Ю.Рожкова, И.Г.Пачулия, Н.В.Мейшвили, В.Г.Чалян «Отцовское поведение, его типы и влияние на выживаемость детенышей у низших обезьян» А.Е.Аникаев, В.Г.Чалян, Н.В.Мейшвили «Исследование развития общего интеллекта у макаков резусов» Г.С.Аникаева, В.Г.Чалян, Н.В.Мейшвили «Структура и поведенческий контекст у содержащихся группами обезьян» Д.В.Боброва, Н.В.Мейшвили, В.Г.Чалян, И.Рогозина, И.Ф.Белокобыльский «Влияние условий содержания и сезонности на смертность и заболеваемость обезьян» И.Г.Пачулия, В.Г.Чалян, Н.В.Мейшвили «Корреляты репродуктивного успеха у самок павианов гамадрилов» Н.А.Черникова «Числовые представления низших обезьян» "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ПРИМАТАХ» ВСТУПИТЕЛЬНОЕ СЛОВО Б.А.Лапин, Россия НИИ медицинской приматологии РАМН Уважаемые коллеги! Позвольте мне открыть конференцию. Мы собрались для того, чтобы обменяться данными наших исследований, обсудить перспективы и направления дальнейших исследований на приматах, возможность кооперации, совместных исследований. Несмотря на ряд трудностей исследования на приматах расширяются, и если в начале прошлого века при создании обезьяньего питомника в Сухуми мы были в одиночестве, вскоре к нам присоединилась в США Йерковская лаборатория, а в настоящее время приматологические учреждения появились на всех континентах. Знаменательным является и то, что страны, традиционно экспортирующие обезьян, переходят к разведению обезьян в питомнике, к строительству приматологических центров, оснащенных современным оборудованием, готовят квалифицированных специалистов и настоятельно предлагают вместо экспорта животных – проведение по договорам экспериментальных исследований. Экспериментальные исследования на животных, моделирование на них инфекционных и неинфекционных заболеваний человека позволяют решать проблемы этиологии, патогенеза и широкого спектра проблем профилактики и лечения этих заболеваний. Вместе с тем допустимость экспериментирования животных широко дискутируется в общей и специальной литературе. Во многих странах возможность использования животных в медико-биологических экспериментах решают специальные этические комиссии, определяющие как необходимость участия в эксперименте животных, так и условия проведения эксперимента. Вместе с тем в настоящее время целесообразность, а в ряде случаев абсолютная необходимость проведения опытов на животных, не вызывает сомнения. Особенно значительны дискуссии, связанные с вовлечением в эксперименты обезьян, объединенных с людьми в один эволюционный отряд приматов. Эволюционное родство обезьян и людей, их анатомо-физиологическое сходство позволяет переносить результаты экспериментов с минимальной коррекцией (или же непосредственно) в человеческую практику, а также рассматривать данные, полученные в экспериментах на обезьянах, как наиболее отражающие аналогичные процессы у людей. Медико-биологические исследования на приматах послужили базой создания нового направления, получившего название медицинская приматология. До последнего времени целесообразность экспериментального использования обезьян основывалась на чисто априорных представлениях о сходстве людей и обезьян. Однако в последнее десятилетие установление многих физиологических закономерностей, биохимических, эндокринологических, генетических и ряда других, характеризующих различные физиологические системы, сделали выбор обезьян в качестве объекта для экспериментов наиболее рациональным. В этом отношении важное значение приобрели сравнительные патологоанатомические исследования нозологического профиля заболеваний обезьян, как бы подсказывающие экспериментаторам перспективные направления использования этих животных при изучении той или иной патологии людей (кстати, сходство нозологического профиля заболеваний обезьян и людей могут служить дополнительным обоснованием эволюционного родства людей и обезьян и их объединения в единый отряд приматов). Ряд исследований, проведенных на приматах в силу оригинальности и значимости, заслуживает специального упоминания. В первую очередь мне хотелось бы упомянуть исследования высшей нервной деятельности, когнитивной физиологии, стресса и неврозов. Среди этих исследований особое значение принадлежало пионерским исследованиям Д.И. Миминошвили, Г.О. Магакяна, Г.Я. Кокая и Г.М. Черкович, разработавших методы получения неврозов у обезьян, осложнявшихся возникновением гипертонической болезни, коронарной недостаточности и, в ряде случаев, инфарктов миокарда и кровоизлияния в мозг, что позволило по-новому рассматривать патогенез этих заболеваний и разрабатывать методы патогенетической терапии. Сходная радиочуствительность обезьян и людей, при действии массивных и малых доз ионизирующего облучения оправдывает использование обезьян для разработки методов профилактики и лечения лучевых поражений. В условиях планируемых межпланетных полетов, когда организм космонавта, находясь в открытом космосе вне защитного слоя магнитосферы Земли, постоянно подвергается облучению малыми дозами ГКЛ и СКЛ, а периодически в момент солнечных вспышек более мощными дозами протонного облучения, экспериментальная разработка в опытах на приматах методов биологической защиты является оправданной и более чем актуальной. По-видимому, следует обратиться к исследованиям Э. Джикидзе и Л. Яковлевой изучавших острую и хроническую лучевую болезнь, а так же к исследованиям Л.Ф. Семенова, Р.Б. Стрелкова, В.С. Баркая и др. показывавших в опытах на обезьянах эффективность химической защиты при остром облучении, а также и хроническом облучении малыми дозами ионизирующей радиации. В этом отношении также представляет интерес опыт Г.С. Стрелина с экранированием даже небольших участков тела с активным кроветворением. Исследования на приматах целесообразно, а в ряде случаев является необходимым этапом при разработке новых лекарств, обеспечивающих безопасность перехода к клиническим исследованиям. Чрезвычайно важным является испытание на обезьянах новых лекарственных средств, предназначенных для применения беременными женщинами, особенно в ранний период беременности, в период формирование эмбриона и плода. Печальный опыт применения контергана (талидомида) у беременных женщин, приведший к множественным уродствам новорожденных, требует, по-видимому, законодательного решения вопроса об испытаниях, на обезьянах новых препаратов предназначенных для беременных женщин. Этот препарат, прошедший испытания на лабораторных животных широко рекомендовался в качестве седативного средства, однако, не был испытан на терратогенность на обезьянах. Как оказалось впоследствии, препарат был высоко тератогенен у представителей отряда приматов. Анализ многочисленных к настоящему времени литературных данных, наш собственный опыт, позволяет прийти к заключению, что экспериментальное использование обезьян дает возможность получать данные, которые невозможно получить на других лабораторных животных. Вместе с тем для принятия решения о вовлечении приматов в эксперимент следует руководиться разработанными нами принципами: А. обезьян возможно и целесообразно использовать в экспериментах при решении крупных, в ряде случаев глобальных проблем; Б. обезьян можно использовать в экспериментах при остутсвии альтернативных моделей, при невозможности воспроизведения изучаемого феномена на других лабораторных животных и невозможности получения на них корректных результатов; В. Обезьян можно использовать в экспериментах в том случае, если они не относятся к видам, которым угрожает исчезновение. Мы рекомендуем отдавать предпочтение животным 2-го и 3-го поколения, родившимся и выросшим в питомнике. Естественно, что общим принципом использования животных в экспериментах является «гуманное» отношение к подопытным животным, его максимальное щажение. Важным направлением экспериментального использования обезьян является инфекционная патология. Их чувствительность ко многим, если не к большинству агентов, возбудителей, бактериальных, вирусных и паразитарных заболеваний человека, нередко наличие у обезьян и людей возбудителей-«двойников», возможность воспроизведения на обезьянах в сходной форме большого количества инфекций человека делают этих животных, нередко незаменимыми объектами исследований в области инфекционной патологии. Немаловажным является то, что к целому ряду бактериальных и вирусных агентов, играющих важную роль в патологии людей, чувствительными помимо человека являются только те или иные виды обезьян. К таким агентам относятся вирусы полиомиелита, вирусы гепатита А и В, вирусы кори, инфекционного паротита, краснухи, оспы, различные виды шигелл. Можно говорить, что создание высокоактивных вакцин против полиомиелита и кори в значительной степени было обусловлено тем, что экспериментаторы имели возможность работать на обезьянах. Создание вакцины против полиомиелита было эпохальным событием, позволившим ликвидировать как эпидемическое заболевание катастрофически быстро распространявшийся полиомиелит. Правда, массовая вакцинация населения, как оказалось впоследствии контаминированной SV-40 вакциной, привела к инфицированию человеческих популяций обезьяньим полиомовирусом SV-40, роль которого в патологии людей неясна, хотя оживленно дискутируется. Однако это не умаляет значения создания полиовакцины и массовой вакцинации населения, а лишь подчеркивает необходимость тщательного контроля вакцин, выращиваемых на культурах клеток животных особенно клеток обезьяньего происхождения. Использование обезьян может оказаться чрезвычайно важным при анализе массовых заболеваний неясной, но предположительно инфекционной природы. В качестве примера приведу установление в 1939 году вирусной природы и выделение вируса дальневосточного энцефалита, когда использование обезьян сыграло важную роль. Пестрота нашей программы в значительной степени связана с уникальными возможностями наших «меньших братьев» для решения важнейших проблем медицины и биологии и лишь подчеркивает значимость приматологических исследований. NON-HUMAN PRIMATES IN RESEARCH IN THE UNITED STATES W.R.Morton Paris NHP Co., Seattle, WA, USA My presentation will focus on the use and numbers of nonhuman primates (NHP) in research in the United States. To determine these numbers it was necessary to visit a lot of regulatory agencies—including the CDC, USDA, and NCRR/NIH (for chimpanzee data)—and Indonesia. The bottom line is that it is very difficult to quantify this in any meaningful sort of way. It seems that nobody really has the number of nonhuman primates that are used in research. In addition, different organizations and agencies count these numbers in different ways. In some instances, it was necessary to go to the animal rights groups or to Wikipedia to find out numbers. After averaging all the numbers, the total is approximately 70,000 to 75,000 nonhuman primates each year, and that includes all types of use, whether they are being bred or held or actually used in research. The CDC has 24 different registered NHP importers in the United States (information provided with the assistance of Bob Mullan and Gail Galland). In the early days of this field, there were over 100 importers of NHP, suggesting that greater regulation has resulted in fewer animals being imported. It is interesting to note that half of these importers are commercial importers, with the rest scattered among zoos and academic institutions. CDC has requirements for licensing a facility. All NHP are required to stay in a federally registered quarantine for at least 31 days. After a federally mandated quarantine of 31 days they can be held longer at the quarantine site or transferred to another institution, most quarantines will last for a period of 90 days. One of the confounding regulations was the requirement for records on these primates as they moved from the initial importing institution to other institutions. The importing institution has to document whether the animals are being held for scientific, exhibition, research, or educational use and that wherever they send the animals will likewise register in similar categories. The intent is to keep these animals out of the pet trade. The CDC inspects facilities, reviews import plans, monitors arriving shipments, assesses disease control measures, reviews animal health records, and investigates illness reports. The data on NHP importation from 1994 to 2009 show a continual increase. In 2005 to 2007, the last three years for which data are available, the number rose to over 25,000 or 26,000 primates per year being brought into this country. This suggests a greater use of nonhuman primates in the United States. If the data are broken down further one finds that over 93% of imported NHP are Macaca fascicularis, or cynomolgus; 5% are M. mulatta, or rhesus, probably from China. The rest are scattered among other species. If one looks at the data by importer, each importer brought in from one to over 9,000 animals, with the number of shipments per importer ranging from one to 70 a year. A significant statistic is the percentage of dead-on-arrivals: zero to 0.2%, which is very low. This is a huge improvement from many years ago when a 10% to 15% mortality rate was considered good. Reportable illnesses are very low now as well. Looking at the importation data further, 60% of these animals are coming from China, followed by Vietnam and Mauritius. Over 85% of the animals are coming from three countries. NIH (then NCRR, now the Director’s Office of NIH) supports eight national primate research centers, which collectively contain almost 28,000 nonhuman primates, with the majority being rhesus monkeys. It becomes clear that it is the rhesus monkey that is used in research, not M. fascicularis (cynomologus). Cynomologus monkeys are used by commercial industries, pharmaceutical industries, or CROs for toxicology, efficacy, safety, and pharmacodynamics. NIH is moving toward the development of so-called specific pathogen–free colonies, which consist primarily of rhesus colonies, M. mulatta. Those colonies are primarily SPF-4, meaning they are free of SIV, STLB, SRV, and herpes B. There are other colonies called “superclean” that have even more viruses eliminated, such as cytomegalovirus, foamy virus, and perhaps others. At this point, roughly 5,000 rhesus monkeys in SPF-4 colonies are being produced for research by investigators throughout the country. There are plans in the national primate research centers program to create even more SPF colonies in the years to come. The major types of research conducted at the primate centers are AIDS and other infectious diseases: these account for over 40% of research activity. Neurobiology research is also prevalent, at almost 20% of activity, and various other areas make up the rest. Many specialized resources emerge from primate center programs. Perhaps one of the more important ones is the NHP tissue program, from which over 42,000 primate tissue samples, organs, genetic samples, cells, fluids, and more are supplied to investigators throughout the nation and internationally. USDA annual reports provided information about how many primates were in use in registered facilities throughout the United States. There are roughly 46,000 or so NHP listed in these reports, either in column B (used for breeding) or columns C and D (used in research, in situations where there is no pain, momentary pain, or pain alleviated with analgesia). Interestingly there were no reports of animals in column E (unrelieved pain and/or distress). This is difficult to understand since there are clearly projects going on at various facilities that fall under column E. In summary, based on these and the previous data, an estimated 70,000 to 75,000 primates are used in research. Now I will address the use of chimpanzees, and I would like to acknowledge the contribution of Tom Butler for the information I will share with you. The most important thing about chimps is that they share roughly 98.5% of their DNA with humans. Therein lies both the benefit and the curse of the issue of chimps in research, and there are many different thoughts about whether or not they should be used for this purpose. Using chimps means increased expense due to the need for larger cages, larger facilities, stronger people, and more educated people. Five centers in the United States maintain chimpanzees: the Southwest Foundation for Biomedical Research (San Antonio, TX), Michale Keeling Center for Comparative Medicine (Bastrop, TX), New Iberia Research Center (Louisiana), Yerkes Primate Center (Atlanta, GA), and Alamogordo Primate Facility (New Mexico). The population of chimpanzees is continually declining. From the latter part of 2006 to the first part of 2007, there was a decline of nearly 100 animals or almost 10% of the chimp population. The population has been declining primarily for health-related reasons. Another consideration is that about half of the animals are owned or subsidized in part by the federal government, which traditionally does not make these chimps available for research by private industry. A key factor is animal age. The desirable age for chimps in many research projects is roughly up to 21 years of age, which is about the time health problems begin developing, particularly cardiovascular problems. As of 2008, only about half of the US chimp population was below the age of 21, further accentuating the declining usable numbers of chimps for research. Given the current rate of decline, the number of chimps for research will be close to zero by the year 2030. While age can exclude chimpanzees from use in research, other factors to consider in choosing animals include behavioral characteristics, health status, experimental history, and current research. So there are very few chimps available for research in the United States. Yet there are those who insist that the chimpanzee is the only animal that can be used specifically for pharmacodynamics in a way that the human is used, to test monoclonal antibodies. Many of these monoclonal antibodies cannot be tested in other warm-blooded mammals or in other NHP species because they are eliminated very rapidly. The chimp is the only animal that processes these monoclonals in a way that they can be tested. Vaccine development is another huge concern in considering research on chimpanzees. The chimpanzee was integral to development of the hepatitis B vaccine and is used to make improvements in it. In addition, it is the only known animal model for hepatitis C and is being used in attempts to develop a hepatitis C vaccine. However, it should be noted that in the early days of AIDS researchers thought chimps would be extremely valuable, but that was not the case. In terms of emerging infectious diseases, many scientists feel strongly that the chimpanzee should not be allowed to disappear from the US research scene. Some argue that it would be foolhardy to let the chimp population disappear and then need the animals again for future critical research. In 1997 the National Research Council published a report that set the stage for the future of chimps with regard to breeding (Chimpanzees in Research: Strategies for Their Ethical Care, Management, and Use). The breeding ban for chimps in federally funded facilities continues today. The report also recommended that euthanasia not be allowed for population control. Along with this, there was a suggestion that a national chimpanzee sanctuary facility be created; Chimp Haven, in Shreveport, Louisiana, took in its first animals in 2005 and now houses about 143 chimps as of June 1. Although the NRC report recommended that there be 1,000 chimps available to meet current research needs, there would need to be 60 births per year. With the federal ban on breeding, there are only about 15 births per year at privately held facilities. Because the population of chimps is aging, it seems certain that the numbers will continually decline. In addition, most chimps have been used for experiments, so there will be virtually no na?ve animals for future studies. In the last part of my presentation, I would like to highlight Indonesia, a typical exporting country for NHP. Most people in the United States are unaware of Indonesia, yet it is the fourth-most populous country in the world, made up of 13,000-plus islands, and home to numerous species of nonhuman primates, including vast numbers of Macaca fascicularis. Much of the following information was obtained from the Indonesian quarantine group, which is responsible for export. Between 2004 and 2007, there was a rapid increase in the numbers of nonhuman primates exported. Most have been going to China, which is rapidly becoming the giant in terms of NHP use as well as NHP export to the United States and other countries. In China, and to a lesser extent in Indonesia, primate centers and research centers are being built. These countries will no longer want to supply NHP to the US and other countries as they will want to develop research enterprises in their own countries. Many people from those countries have been educated in the United States and Europe and are beginning to feel ready to do research back home. For example, the Bogor Primate Research Center in Indonesia has the capacity for many major types of research procedures, including those that involve ABSL-3 facilities. Many cutting-edge research projects are ongoing in conjunction with laboratories in that country. The center has virology labs that are as large and as well equipped as those in the United States. This is happening because the Indonesian government and others have invested money and training and now they are prepared to undertake research projects on their own. These types of activities are occurring in many other countries of origin of NHP. These countries are very capable and they are looking to increase these activities. I will conclude by explaining why there is an increase in NHP exportation. Breeding colonies are developing everywhere in Indonesia because new laws prohibit the exportation of feral animals. Countries of origin such as Indonesia, China, India, and others will be requesting outsourcing of research from the United States. In summary, obtaining accurate numbers of NHP used in research is difficult at best, but the trend is increasing, not decreasing. The need for research using chimpanzees remains controversial, but they will continue to be used at least in the short term. I would like to thank Bob Mullan and Gail Galland from CDC, John Harding from NIH, Tom Butler (retired) for giving me the chimp data, Joko Pamungkas and others from the Bogor Primate Center and the quarantine division of the Indonesian governments, and Pam Ferguson and Patti Rosendahl from Paris nhp. EUPRIM-NET: ENSURING BEST PRACTICE AND ADVANCING THE 3Rs IN PRIMATE RESEARCH S. Treue1, K. Prinz1, B. Pauling1, R. Teepe1 1German Primate Center, Goettingen, Germany Of the 12 million animals used in scientific procedures in the EU each year, less than 1% (around 10.000) are non-human primates, mostly used for pharmacological and toxicological tests and to a small extent for research purposes. Although the percentage share is very small, the use of primates is in a critical focus of both politicians and the general public. However, the need for research on and with NHPs is recognised by all governments supporting internationally competitive biomedical research which addresses the world’s most pressing medical challenges. In order to meet the highest ethical standards in using these sentient animals while ensuring top-level research, with EUPRIM-Net a virtual European Primate Centre was created that provides the basis for internationally competitive state-of-the-art research. The EU-funded research infrastructure project brings together the unique facilities of nine publicly-funded primate centres, combining their wide range of R&D activities, extensive knowledge and infrastructure resources as well as their solid experience in primate housing and breeding. Core objectives are to advance the 3Rs (refinement, reduction, replacement) in primate research, to develop, refine and ensure best practice in animal care and use as well as to improve the availability of non-human primates of high quality. The network aims at developing and standardising procedures and methods for the use, housing and breeding of non-human primates and offers European scientists easy access to excellent infrastructures and services, e.g. by providing and developing training courses for researchers and caretakers working with primates and ensuring access to biological material of primate origin. Established in 2006, EUPRIM-Net is by now a leading voice for the best science meeting the highest ethical standards in research with non-human primates owing to the successes and achievements of the first period of the project. In the coming years, the consortium pursues a strong focus on extending the network to include non-European primate centres as well as commercial companies to insure a global sharing of available resources. INTERNATIONAL PRIMATE PLAN: PROPOSAL FOR A GLOBAL COLLABORATIVE INITIATIVE J. W. Kemnitz1 for the International Committee of ILAR Council2 Institute of Laboratory Animal Research, the National Academies Washington, DC USA The Institute for Laboratory Animal Research (ILAR) of the National Academies plans to develop an international primate plan (IPP) to ensure access to and availability of high quality, well-characterized nonhuman primates (NHPs) and their tissues to support necessary biomedical research and testing globally. Because NHPs continue to be a vital model for many human diseases, it is essential that an effort by all countries that breed, use and/or export NHPs be initiated and coordinated to ensure that these animals are provided with appropriate care, efficiently utilized, and shared where scientifically appropriate. Essential to this effort is the use of advanced bioinformatics infrastructure that will enable the creation of a sustainable electronic global system for sharing primate resources and promoting good practices for the care and use of NHPs. ILAR is collaborating with others internationally to fund, develop and deliver this plan. Specifically, the IPP will: 1. Define parameters of global supply and demand for NHP in order to address current and project future requirements for NHP. A comparative analysis of genetic, microbial and behavioral characteristics across NHP species will be included. 2. Establish a worldwide Web-based network for sharing tissue and/or animals, as well as facilitating knowledge and technology transfer among collaborators. Related IT systems and online databases (e.g., normative values, biorepositories) used or funded by the project partners will be harmonized and shared as one global resource. This will provide global access to reference laboratories, print and electronic resources, e.g. books, journals and other pertinent publications, and other important research tools. 3. Address current barriers to expeditious transportation of NHP and consider alternatives to unnecessarily complex transportation practices. International trade issues that may affect global cooperation for NHP, such as adherence to CITES, and religious, language, cultural, conservation and geopolitical challenges, will also be considered. 4. Develop global guidelines for the appropriate care and use of NHP. These guidelines would address acceptable standards for NHP facilities and provide guidance for optimal welfare of these animals, taking into account ethical (the 3Rs; research integrity), methodological (research protocols), and training (scientific, veterinary and animal care staff education) requirements. 5. Identify a funding strategy to maintain these resources and keep them “alive” and up-to-date. Background The use of NHP in biomedical research and testing is critical for understanding of primate biology and essential safety assessment for the foreseeable future. Despite international efforts to encourage the use of species other than NHP wherever possible, the next decade will most likely see an increasing demand for NHP resources globally. This obvious trend is caused by advances at molecular, cellular, and whole organism levels in questions related to developmental biology, neuroscience, and immunology, among other areas of investigation. Indeed, NHP are being used for the study of basic biological mechanisms; for advanced studies in behavior and brain function; for the study of mechanisms and interventions for infectious diseases, including HIV/AIDS, drug-resistant tuberculosis, malaria, and emerging agents; for safety testing of novel therapeutic agents and biologics, such as monoclonal antibodies, RNA interference (RNAi) therapeutics, and vaccines; and for biodefense-related research.. As our knowledge at the gene level becomes more precise, the requirements for physiological follow-through at the cell, organ and whole animal levels will be essential for our understanding of function and for the development of new therapies. We now know that NHP systems at each of these levels are often most appropriate as models for human disease or natural mechanisms when compared with non-primate systems. The continued need for NHP in research and testing was recently affirmed by their continued inclusion in the new European Directive 2010/63/EU, although special provisions have been placed on research using great apes. There have been no efforts to ban the use of NHP in the US or Canada, although legislation to restrict the use of great apes has been proposed in the US Congress. Other countries such as New Zealand, The Netherlands and Austria, already ban certain NHP use for research purposes. Given the continuing requirement for NHP in biomedical research and testing for the foreseeable future, many scientists and veterinarians have expressed concern about the continued availability of quality animals. The US, which is the primary user of NHP globally, imports almost 30,000 animals per year; Europe imports significantly less, in the order of 7000 annually. Primary suppliers of primates are China, Vietnam and Mauritius, with Cambodia entering the market. While continuity of supply of animals from these countries may not currently be of significant concern, there are several issues that have arisen that may compromise this practice in the future. One major factor is that many developing countries, who either lack or have limited laws governing the care and use of laboratory animals, are striving to build their own research facilities to take advantage of their indigenous resources and establish themselves as biomedical research-intensive locations. It is, therefore, conceivable that the governments of these countries may in the future curtail or even halt the export of NHP to better support their own burgeoning research enterprises. In addition, the emergence of new primate breeding centers and facilities in supplier countries, where native NHP species may be wild-caught and put into captivity for research or testing purposes, is significant. Many institutions – pharmaceutical and contract research organizations, as well as some universities – have established their own facilities or programs in these countries, partly due to the lower costs involved in doing research there, partly because the quality of animal care in these facilities is similar with that of the parent organization, and partly because doing so obviates the need to transport large numbers of NHP over long distances. The development of an international primate plan will foster collaboration and cooperation among scientists, veterinarians, breeders, academic institutions, governments and private industry across the globe to responsibly manage NHP resources, ensure the appropriate care and conservation of these animals, create a sustainable global bioinformatics system for sharing information, and develop practice standards for the well-being and welfare of these animals. This study will be of international importance in a number of ways: 1) in preserving and developing an irreplaceable resource for the future of human and animal health, 2) in ensuring the appropriate care and use of NHP with full consideration of the ethical issues surrounding their utilization, 3) in providing for the detailed characterization of the animals such that all those working with them will be fully informed – which will aid in the interpretation of data and reproducibility of results, 4) in establishing an international informatics network for sharing information and resources, and 5) in positively impacting the development of scientific research endeavors in emerging countries. The study will also provide a careful analysis of current numbers and future projections of NHP resources, take conservation efforts into consideration, and identify priority areas of basic, strategic and applied research for which these resources will be essential in ensuring international cooperation in health and related industries. Work Plan The project is to be performed by an ad hoc international committee of 12-15 individuals in accordance with National Academy of Sciences guidelines. The committee members will be drawn from the international community and will, among them, have knowledge of NHP species and usage, areas of research in which availability of NHP is critical, techniques for microbiological characterization of NHP, genetics of NHP, bioinformatics, technologies for genomics and gene mapping/sequencing, conservation issues, NHP veterinary medicine, animal welfare issues specific to NHP, ethical issues pertaining to the use of NHP in research, nonhuman primate conservation issues, and research needs in emerging countries. To enable and embody the international purpose of this project, ILAR will seek collaborators in Europe and Asia, as well as North America and other regions who see this to serve their interests. It should be noted that participants in EUPRIM-Net, with funding from the European Union, have already developed systems that lay a foundation for the proposed global plan. Representatives from other countries, such as China, have voiced their enthusiasm for participating. In order to engage the views of representatives from all countries that act as NHP sources and those that use NHP in research and testing, to include all types of NHP users and stakeholders; and to address issues of conservation/sustainability of NHP resources, three 2-day workshops will be convened to address the five themes previously outlined. Each workshop will take place at a partnering country/region, likely China, Europe and the United States. Tools such as webinars and videoconferences will also be used to complement the workshops, minimize costs and maximize collaborative efforts. In addition, all constituencies will be invited to submit comments and other information electronically. It is anticipated that the committee will meet once to plan the three workshops, establish working groups and lay out the timeline for the completion of the project. This meeting will last 2-3 days and will be held in Washington, DC. . The committee will engage at the workshops and convene immediately afterwards to assess outcomes, and members will continue to work in between workshops and meet after the completion of the last workshop for 2-3 days in Washington, DC. A consensus report will be published. Acknowledgements. We are grateful to the management team of EUPRIM-Net, Drs. Stefan Treue, Robert Teepe, Bj?rg Pauling and Katrin Prinz of DPZ G?ttingen, who have welcomed this collaborative effort, and to Dr. Weizhi Ji of the Kunming Primate Research Center for his willingness to partner in this project. 1Corresponding author: Joseph W. Kemnitz, Ph.D., Wisconsin National Primate Research Center, University of Wisconsin-Madison, 1220 Capitol Court, Madison, WI 53715 USA 2Contributing members of ILAR Council and ILAR staff: Lida Anestidou, DVM, PhD (Washington, DC, USA), Stephen Barthold, DVM, PhD (Davis, CA, USA), Kathryn Bayne, DVM, PhD (Frederick, MD, USA) Jeffrey Everitt, DVM (Raleigh-Durham, NC, USA); James Fox, DVM (Cambridge, MA, USA), Coenrad Hendriksen, DVM, PhD (Utrecht, Netherlands), Judy MacArthur Clark, DVMS (London, UK); Timo Nevalainen, DVM, PhD (Kuopia, Finland), Fran Sharples, PhD (Washington, DC), and Joanne Zurlo, PhD (Baltimore, MD, USA) FORMATION AND DEVELOPMENT OF BIOMEDICAL RESEARCH ON PRIMATES IN ABKHAZIA (HISTORY, PEOPLE, EVENTS, FACTS) Z. Mikvabiya, V. Agrba, E. Fridman The publication represents history of foundation, development , a world recognition and at last a tragic position of IEPT AMS USSR due to disintegration of the USSR (1991) and Georgia-Abkhazia military conflict ( 1992-1993). Foundation of Primate Research Center in Abkhazia, Sukhum was realization of I.I. Mechnikov’s research dream to create special facilities for biomedical investigations on monkeys (1915). The idea of foundation a big monkey colony belonged to three persons : to the 1st People’s Komissar of health of the USSR N.A. Semashko, to an outstanding biologist I.I. Ivanov and also to the colonel of veterinary service of imperial army, a well known endocrinologist Ya.I. Tobolkin. Climate conditions of the Caucasian Black Sea coast in the area Gagra-Sukhum have been recognized the most suitable for such monkey colony. On the February 4, 1927 an agreement was signed between the Government of Abkhazia and the Institute of Experimental Endocrinology on transfer of a site of land on the hill Trapetsia for building a monkey colony. N.A. Lakoba signed the Agreement on behalf of Abkhazia and Ya. A.Tobolkin on behalf of the Institute. First monkeys were brought to Sukhum on August 24, 1927 and this date is considered as beginning of a monkey colony which in a consequence became a world known research center – the Institute of Experimental Pathology and Therapy of the Academy of Medical Sciences of the USSR (IEPT AMS USSR). Medical society and People’s Komissar of health of Abkhazia met the news with approval. A great contribution to Institute development has been made by I.P.Pavlov’s student and colleague L.N. Voskresenski, which became its first director, N.V. Bochkarev who carried out fundamental investigations on biology and physiology of monkeys, N.N. Petrov who founded the first laboratory of experimental cancer research, L.A. Zilber – the founder of national oncovirology, and many others. ИСТОРИЧЕСКИЙ ПУТЬ МЕДИЦИНСКОЙ ПРИМАТОЛОГИИ Э.П. Фридман Хадера, Израиль Человек столкнулся с другими приматами ещё в доисторические времена, чему протокольно свидетельствуют находки палеонтологов, относящиеся ко времени палеолита (Индонезия), а также наскальные изображения обезьян в пещерах (например, на юге Франции). Естественно, когда человек достиг интеллектуального уровня интереса к науке, исследователи не могли не обратить внимания на такой колоритный объект как обезьяна. Египетские жрецы уже разделывали трупы обезьян с ритуальной целью. Античное время оставило нам (из того, что дошло до нас) рассуждения Аристотеля (IV в. до н.э.) о первоначальном группировании низших обезьян, упоминали о них и Гераклит, Гиппократ, Квинтилиан. Плиний Старший (II в. н.э.) пытался описать всё, что было известно в его время об обезьянах, включая немало слухов. Все упомянутые авторы отмечали сходство этих животных с человеком. Знаменитый медик древности Клавдий Гален (130 --201) анатомировал обезьян и оставил весьма противоречивые сведения о своих опытах, что обнаружил Андрэ Везалий в своём классическом труде (1543) «О строении человеческого тела» ( не менее 200 ошибок), за что, между прочим, жестоко пострадал. Грамматик Гораполло уже в IV веке отметил, что самки обезьян подвержены периодическим истечениям крови, а теолог и натуралист Альберт Магнус в ХIII веке обнаружил особое сходство обезьян с человеком, чуть ли не «связующее звено» с ним, хотя ещё искренне верил в существование «монстров». С наступлением Возрождения и затем Нового времени появляются сообщения об обезьянах путешественников, миссионеров, купцов и других «бывалых людей», сведения которых далеко не всегда достоверны, но и они иногда обобщаются (Конрад Геснер, 1551). Первой научной публикацией специально по обезьянам следует, очевидно, принять, работу известного голландского врача Николаса Тульпиуса (в России -Тульп ) по анатомии шимпанзе (1641), где приводятся и некоторые сравнения с анатомией человека. Семнадцатый век отмечен ещё одной заметной научной работой - публикацией знаменитого врача Томаса Виллиса «Анатомия мозга» (1664), где он поражён сходством мозга человека и обезьяны. Однако блистательным финалом века для будущей приматологии (запомним: все остальные века, к чему мы ешё обратимся, именно к концу века почему-то особо отличаются в истории этой науки) - финалом ХVII в. стала подлинно научная книга выдающегося английского анатома Эдварда Тайсона (Tyson, 1650-1708) «Orang – Outang, sive Homo Sylvestris or, the ANATOMY of a PYGMIE. Сompared with that of a Monkey, and Ape, and a Man.» (1699), опубликованная после того, как учёный доложил 1 июня 1698 года свои данные на заседании Лондонского Королевского общества: шимпанзе (это был именно этот гоминоид) демонстрирует 48 признаков сходства и 34 отличия от человека. Все признаки подробно рассмотрены. И вот вывод: «…Наш Pygmie не человек, но даже и не обычная высшая обезьяна (у Тайсона: Common Ape ), а форма животного между обоими, и даже двуногое» (Tyson, p. 91. Жирный шрифт – мой - Э.Ф.). Книга Тайсона не раз переиздавалась, в том числе в 1969 году, а скелет его «Пигми» доныне демонстрируется в Британском музее. Профессор Эдвард Тайсон – первый классик приматологии. Нет необходимости в контексте нашего доклада говорить о многих, даже крупных работах по приматам в историческом аспекте, назовём лишь самые знаменитые, заметно повлиявшие на формирование науки приматологии. Карл Линней (1707 - 1778) с середины XVIII века, но мы ведём таксономический отсчёт с десятого издания его «Systema naturae» (1758), закрепил единый отряд человека, обезьян и полуобезьян, дав ему (современное и для нас) название PRIMATES. Это был сильнейший стимул к развитию науки, хотя заметим, что таксономия Линнея была основана на так называемой «искусственной систематике». В те же приблизительно годы публиковал свои труды автор 44-томной «Естественной истории» знаменитый французский естествоиспытатель Жорж Бюффон (1707- 1788), который в 14 томе и в двух Приложениях поместил раздел «Номенклатура обезьян». Ценность этой работы заключается в расширении списка известных приматов и особенно в описании и внятном именовании гиббона, чего нельзя сказать об орангутане, сведения о котором путаны и у Бюффона. Вскоре, однако, отряд Приматов стараниями креационистов был расчленён на два отряда: «Двурукого» (человек) и «Четвероруких» (все обезьяны). Сделано это было видным немецким анатомом и основателем антропологии Иоганом Блюменбахом (1752-1840) в 1775 г., а термин «приматы» был изгнан из науки и школы почти на 100 лет. Единый отряд восстановлен (с линеевским названием «Приматы») выдающимся исследователем, активным сторонником Ч.Дарвина и будущим Президентом Лондонского Королевского общества Томасом Гексли (1825- 1895) в 1863г. Несмотря на бурные идеологические страсти, к концу XVIII в. достигнуты крупные успехи в познании обезьян и полуобезьян. Благодаря работе французского натуралиста - эволюциониста Этьена Жоффруа Сент-Илера (1772 -1844) в середине 90-х гг. описаны в целом фактически все группы полуобезьян (им же закреплено разделение обезьян на узконосых и широконосых, 1812). В отдельных публикациях уже дифференцируются, иногда с современными тривиальными названиями, три формы человекообразных: гиббон, шимпанзе и орангутан, но без чёткого таксономического определения (которое затянулось до наших дней). Открытие гориллы, самого крупного гоминоида, стало уже делом ХIХ века (1847). На этот же век пришлась самая большая вершина в истории приматологии – речь о великих трудах Чарлза Дарвина (1809-1882): «Происхождение видов путём естественного отбора…» (1859) и «Происхождение человека и половой отбор» (1871). Дарвин не только дал гениальные теоретические положения, он, между прочим, касался не менее 25 (по нашим подсчётам) видов обезьян и посвятил им отдельную публикацию в «Нейчур» (1876). Но, разумеется, далеко не в этом состоит его вклад в развитие приматологии. Он обосновал и авторитетно закрепил филогенетическую компактность единого отряда Приматов и поставил всю систематику (не только приматов) на подлинно научную основу, на основу естественного развития организмов («естественная систематика»), он показал истоки сходства организмов – они, как правило, в общем происхождении и, в частности, сходство человека и высших обезьян - в общем происхождении их от древних приматов третичного периода… Обратим внимание на замечание Дарвина по поводу книги Гексли, который вернул человека в один отряд с другими приматами: его (человека) следует разместить, учитывая данные науки, лишь в отдельном семействе в пределах отряда «…а может быть даже лишь в отдельном подсемействе» (Дарвин, 1871, стр.219). Наконец, Чарльз Дарвин первым указал на особую ценность обезьян как объектов науки и на сходство патологии человека и обезьян, открыв путь к современной медицинской приматологии. Более того, сразу же после публикации «Происхождения человека» в следующем году (1872) Дарвин издаёт известную монографию «О выражении ощущений у человека и животных», где содержится прямая рекомендация использовать обезьян в физиологических исследованиях (стр. 332). Блок-схема отряда приматов. Схема классификации современных гоминоидов. Чтобы завершить наш очень краткий экскурс в историю приматологии собственно, сообщим, что после трудов Дарвина и Гексли, несмотря на яростную полемику в среде учёных вокруг их идей, к концу века шло интенсивное накопление знаний о приматах с открытием и наименованием новых видов, дано чёткое научное определение представителей отряда (С-т. Дж. Майварт, 1827-1900). В начале ХХ в. была открыта горная горилла, к концу 20-х гг. обнаружен ещё один вид шимпанзе – бонобо. В 30-х гг. активно изучаются обезьяны на воле в местах естественного распространения. В начале 40-х гг. появляется термин приматология, утверждённый замечательным американским приматологом Теодором Ру в его фундаментальной «Библиографии…» (1941). Создаются капитальные труды по анатомии приматов, систематике, спонтанной патологии… Выходят периодические и крупные отдельные научные издания. Создаётся Международное приматологическое общество (1963). Можно считать, что в начале 60-х гг. сложилась современная наука приматология, хотя ряд её важнейших положений сформулированы к концу ХХ века. Именно к концу (!) ХХ в. завершилась многолетняя (если не многовековая) история определения таксономического статуса современных гоминоидов [виды: гиббоны, орангутан, горилла, шимпанзе обыкновенный, шимпанзе карликовый, или (синоним) бонобо]. В течении более 100 лет,как упомянуто, учёные отстаивали место человека в отряде Приматов, после этого прошло ещё 70 лет для того, чтобы поместить человека и высших обезьян в одно надсемейство и, наконец, в 1996 году появилась статья маститого молекулярного биолога, руководителя детройской группы исследователей Мориса Гудмана (ДНК шимпанзе на 98-99 % сходна с таковой человека), название которой начинается словом «Epilogue», а затем его же с его сотрудниками статья вместе с присоедившимися, наконец, палеоантропологами, анатомами и систематиками (1998) о филогенетической классификации приматов, которая вполне обоснованно и с разных позиций удостоверяет: три рода современных крупных гоминоидов должны быть включены в семейство человека (Hominidae), а шимпанзе и горилла - в одно с ним подсемейство (Homininae) и даже – оба шимпанзе – не только в одну трибу с человеком (Hominini), но и в одну подтрибу (Hominina) !.. Теперь можно поговорить конкретнее о медицинской приматологии. Редкие медицинские опыты на обезьянах известны со II тысячелетия до нашей эры (египетские жрецы - анатомы); использовал обезьян и упоминавшийся Гиппократ, а также другие древнегреческие медики (Руфус из Эфеса, александрийские врачи) и , конечно, Гален. Известны спорадические опыты на обезьянах выдающихся медиков Востока – Авиценна, Ар-Рази , Джуханна-ибн-Масавай (IX- X вв.). О Везалии уже говорилось. В XIX в. на обезьянах ставились довольно многочисленные опыты по сифилису, туберкулёзу, возвратному тифу, иногда и крупными учёными. Тем не менее эти опыты были случайными, без учёта эволюционной близости подопытных к человеку, без биологических сведений об обезьянах; как отмечал позже И.И.Мечников, никогда не определялся таксономический статус примата («макак большого размера», «большая обезьяна типа павиана» и т.п.- из протоколов опытов крупного английского физиолога Д. Ферье (1875). Эти исследования ещё проводились в полном отрыве от идей эволюции. В итоге - несмотря на попытки, до самого ХХ в. не были получены модели полиомиелита, сифилиса, брюшного и сыпного тифа и других инфекций. Для зарождения и развития подлинно научного и теоретически обоснованного направления использования обезьян в биомедицинских экспериментах необходимы были по меньшей мере следующие три предпосылки: 1. Высокий уровень развития экспериментальной медицины. По оценке первого Нобелевского лауреата России академика И. П. Павлова (1849-1936) , трудами Ф.Мажанди и К.Бернара (а также, добавим, Л. Пастера, Р. Коха, Дж. Листера ) такой уровень был достигнут в 80-х гг. XIX в. 2. Достаточный уровень научного знания обезьян, а также известный объём знаний по сравнительной приматологии, что, несмотря на отставание таксономии, можно считать достигнутым во второй половине XIX в. ( Ч. Дарвин, Т. Гексли, Р. Оуэн, Э.Геккель, К.Фогт и др.; даже по отдельным системам организма приматов: церебрологии, эмбриологии, по крови). 3. Утверждение идей эволюции в медицинских науках. Эту задачу выполняли редкие учёные в разных странах, но главенствующую роль сыграл второй российский Нобелевский лауреат - Илья Ильич Мечников (1845 - 1916), который является основателем медицинской приматологии. Именно Мечников, работавший в Институте Пастера (Париж) с 1888г. в своих теоретических трудах («Этюды о природе человека», «Дарвинизм и медицина», «Миросозерцание и медицина», во многих статьях и речах) разработал первые теоретические положения медицинской приматологии, и в экспериментальных исследованиях, «на практике» продемонстрировал плодотворность использования обезьян в медико-биологических опытах, впервые получив в них модели сифилиса, возвратного тифа, брюшного тифа, установил этиологию протейной инфекции (поносы грудных детей), изучал другие инфекции, а также заложил основы геронтологии. Одной из причин неудач прежних экспериментаторов он считал, как упомянуто, незнание таксономического положения подопытных обезьян, незнание уровня их биологического сходства с человеком. И именно Мечников впервые публично высказал идею создания питомников обезьян для медицинских исследований (1915 г.). Заметим, что тогда же опубликовал свои предложения о необходимости организации станции для изучения поведения высших обезьян будущий американский классик приматологии Роберт Йеркс (1876 - 1956), к которому впоследствии дважды приезжал И.П.Павлов в Йельский университет и который и сам ездил в Ленинград к Павлову в Колтуши. Р. Йеркс создал свою колонию во Флориде в 1930 г. Но как хорошо известно присутствующим, да и всему научному миру, в то время уже существовал Сухумский питомник обезьян, созданный с большими материальными и организационными трудностями в конце августа 1927 года наркомом здравоохранения Н.А. Семашко, профессором И. И. Ивановым и известным московским эндокринологом доктором Я.А. Тоболкиным. Создание Сухумского питомника обезьян независимо, от конкретных намерений его организаторов, стало началом нового этапа развития медицинской приматологии - этапа многопрофильных медико-биологических исследований на базе крупных приматологических центров вне районов естественного распространения обезьян. Опыт Сухумского питомника - Субтропического филиала ВИЭМ- Медико-биологической станции- Института экспериментальной патологии и терапии, наконец Института медицинской приматологии Академии медицинских наук России поистине бесценен. Этот опыт использовался, в частности, при переходе знаменитой колонии Р. Йеркса от Лаборатории поведения шимпанзе к многопрофильному медицинскому научному центру, коим он ныне является; при исследованиях существовавшей примерно 15 лет до II-й мировой войны колонии макаков К.Гартмана (США), где была изучена на приматах физиология овариально-менструального цикла женшины и впервые зафиксирован на плёнке процесс родов у макаков, - в архиве ИЭПиТ имеются письма Роберта Йеркса и Карла Гартмана. Наконец, перед осуществлением в США крупнейшей научно-стратегической акции – создание в стране сети медицинских центров приматов (60-е гг. ХХв.) , ныне имеющих за свои заслуги звания «Национальных»,- Поль Дадли Уайт (1886-1973), личный врач Президента страны и сам Президент Всемирной ассоциации кардиологов, дважды приезжал в СССР с коллегами для ознакомления с опытом сухумских учёных. Сейчас таких центров в США восемь. Имеются в этой стране и другие приматцентры. Подобные экспедиции иностранных учёных были неоднократны -- при организации Германского приматологического центра, центров в Японии, Франции, на Филиппинах и др. Приматологические центры – современное лицо медицинской приматологии. К концу ХХ века в мире функционировало не менее 100 приматцентров различных масштабов и направлений науки (Intern.Direct.of Primatol.,1994). На фоне выдающихся достижений в определении роли и структуры нуклеиновых кислот, подъёма генетики, онковирусологии, в изучении инфекций и нейро-фармакологии, а также открытий в палеоприматогии и расширения космических полётов в 60 - 70-х гг. ХХ в. наступил расцвет медицинской приматологии. В 1975 г. число научных публикаций в этой области превысило 5 тысяч, это больше, чем во всём мире от Аристотеля до II Мировой войны. И этот расцвет имел место в значительной мере при катализаторской роли сухумского Центра. Можно с уверенностью говорить, что военные действия в Абхазии причинили серьёзный ущерб не только старейшему в мире приматологическому Центру в Сухуми с его мощной местной научной базой и 4-мя филиалами и заказниками, насчитывавшими около 7 тысяч обезьян, но и всей медицинской приматологии мира, ибо на наших глазах усилиями этого Центра зарождался её новый этап – этап массового разведения экспериментальных приматов с максимально полными биологическими характеристиками и эпидемиологической чистотой, что несомненно вызвало бы новый подъём экспериментальной науки и в то же время ослабило растущий кризис сохранения приматов в местах естественного обитания. Вероятно, нет необходимости в данной аудитории подробно говорить о научных достижениях медицинской приматологии – позвольте сослаться на доклад на прошлой Конференции (Фридман,2007). Десяток Нобелевских премий (как минимум!) за исследования, связанные с использованием подопытных приматов, убедительно свидетельствуют о непревзойдённой ценности таких экспериментов. В опытах на обезьянах были решены самые острые проблемы медицины: жёлтая лихорадка, полиомиелит, сыпной тиф, куру и другие нейроинфекции, применение пенициллина и очень многие другие. Даже в наш меркантильный век человечество не может скупиться на затраты для обезвреживания врагов, угрожающих его существованию, -- таких, как рак, СПИД, болезни сердца, опасные инфекции или болезнь Альцгеймера, как талидомидная трагедия, - всего этого не устранить без использования в экспериментах обезьян. Да простят меня коллеги из других приматологических центров мира, особенно, процветающих ныне американских центров, за подробности -- без малейшего преувеличения! – в изложении роли ИЭПиТ - ИМП в истории медико-биологических исследований на обезьянах, учитывая действительные факты и обстоятельства, а также замечательный повод для проведения данной Конференции. Но позвольте ещё раз обратиться к Сухумско-Адлерской главе развития медицинской приматологии. В учреждениях на базе питомника зарегистрировано до Б.А.Лапина 9 штатных руководителей – директоров. Редко кто из них находился на этом особо беспокойном посту 5 лет (всего двое). Назовём всех: профессор Л.Н. Воскресенский, Н.А. Валицкий, П.В. Лебединский, член-корреспондент АН СССР Л.Г.Воронин, И.С.Канфор, А.И.Агапов, Г.А. Левитина, Г.Ю.Малис, И.А.Уткин. В совокупности они руководили учреждением около 25 лет (были годы, когда вовсе не было штатных директоров). Таким образом, академик Лапин, который формально руководит учреждением с 1959 г, то есть 52 года - в 2 раза дольше, чем все директора до него, взятые вместе. Нельзя не сказать в докладе по истории науки об умении юбиляра собирать, выращивать и сплачивать научные кадры, «ставки» на которых всю жизнь надо было «выбивать», о создании им целого Института в тяжелейшее для страны время, о его способности выбирать и ставить наиболее актуальные научные задачи и с беспримерной силой воли добиваться их решения, о его личном вкладе в составляющие медицинской приматологии - спонтанную патологию и биологию обезьян, в развитие возможностей акклиматизации приматов, в онковирусологию, что отмечено Государственной премией России, не сказать о его «тихой» роли в развитие российской космонавтики, работы, удостоенной Правительственной премии и других наград, наконец, о его уникальной роли в установлении международных связей медицинских приматологов, причём во времена, когда даже переписка с заграницей настораживала и сопровождалась какой-то порочной тенью. А ИЭПиТ регулярно устраивал весьма хлопотные, даже тяжёлые для директора и его сотрудников, международные симпозиумы и конференции, вводил у себя штатные подразделения связи с заграницей, посылал своих учёных на зарубежные собрания и практику, сам при любых обстоятельствах участвовал в международных конгрессах и постоянно принимал своих коллег из-за границы. Медицинскую приматологию опекала редкая удача: научный преемник И.И. Мечникова расширил его планы до масштабов, о которых выдающийся российский классик и мечтать не мог. Сегодня академик АМН России Борис Аркадьевич Лапин – единственный современный классик столь необходимой человечеству медицинской приматологии. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ОБЕЗЬЯНАХ: НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ А.И. Григорьев, И.Б. Козловская, А.М. Бадаква ГНЦ РФ – ИМБП РАН, Москва После завершения экспериментов на обезьянах Macaca mulatta в полетах шести биоспутников серии «Космос», направленных на изучение механизмов действия факторов космического полета на организм, в ГНЦ РФ – ИМБП РАН были развернуты наземные модельные исследования на обезьянах, целью которых было получение информации о механизмах адаптации организма к воздействию невесомости, о продолжительности ее последействия и эффективности профилактических мероприятий. На двух группах обезьян (по 12 животных в каждой) в возрасте 3.5-5.0 лет массой 4.5-7.0 кг были проведены исследования влияния длительной антиортостатической гипокинезии (АНОГ) и 9-суточного иммерсионного воздействия на физиологические системы организма. Для мониторинга умственной работоспособности и психоэмоционального состояния обезьян была использована автоматизированная компьютерная психологическая тестовая система. Выработка сложного инструментального рефлекса у животных производится в ситуации компьютерной игры. Обезьяна самостоятельно обучается решать предложенную на экране дисплея видеозадачу, управляя движением руки джойстиком, «поражая цель» и получая пищевое подкрепление. В первые 3 дня пребывания обезьян как в АНОГ, так и в иммерсии число обращений к компьютеру уменьшалось практически до нуля, т.е. происходило глубокое торможение игровой мотивации, свидетельствующее о стрессирующем воздействии условий экспериментов на высшую нервную деятельность. В дальнейшем прослеживалась тенденция к восстановлению условно-рефлекторной деятельности животных, однако исходный уровень мотивации по отношению к компьютерной игре и успешность выполнения зрительно-моторной задачи в течение оптимального временного промежутка восстанавливались у обезьян только после их возвращения в виварные клетки. Исследования гематологического статуса обезьян показало, что уже через сутки пребывание животных в иммерсии и АНОГ вызвало нейтрофильный лейкоцитоз и лимфопению, что указывает на развитие неспецифической стрессорной реакции. Гистоморфологическое исследо-вание подвздошных костей обезьян показало, что их пребывание в условиях иммерсии привело к развитию остеопении. Снижение количества губчатой костной ткани в гребешке подвздошной кости происходило как в результате уменьшения толщины костных трабекул, так и их числа, что привело к разряжению спонгиозы и увеличению расстояния между трабекулами. Скорость развития атрофических изменений в подвздошной кости обезьян вследствие иммерсии превышала таковую вследствие пребывания животных в условиях АНОГ. После иммерсии значительно уменьшалась площадь поперечного сечения как постуральной, так и в большей степени локомоторной мышцы. Редукция размеров локомоторной мышцы оказалась одинаково выраженной для волокон быстрого и медленного типа. В постуральной мышце атрофические изменения были более глубокими в волокнах медленного типа, чем быстрого. Изменения размеров мышечных волокон в m. vastus lateralis были более резкими вследствие иммерсии по сравнению с воздействием АНОГ. На 12 обезьянах проведены исследования с использованием гравитационных воздействий (ГВ), создаваемых вращением на центрифуге короткого радиуса. До и через 28 сут АНОГ у животных с помощью изотопных методов исследовали показатели кровообращения, проводили гематологические и биохимические исследования. После завершения АНОГ проводили биопсию мышечной ткани. ГВ оказали положительное влияние на величину кровотока в мышцах задних конечностей и существенно снижали развивающиеся в АНОГ негативные изменения белкового метаболизма, что, вероятно, свидетельствует о замедлении под влиянием ГВ развития атрофических процессов в скелетной мускулатуре. ГВ снизили выраженность атрофии мышечных волокон обоих типов в m. soleus и m. vastus lateralis. Таким образом, было показано, что применение ГВ направления +Gz (голова-таз) величиной 1.2-1.6 G, длительностью до 30 мин, с периодичностью 4-5 раз в неделю способствует профилактике неблагоприятных проявлений гипокинетического синдрома у обезьян. В настоящее время в Институте проводятся интенсивные исследования по разработке и применению интерфейса мозг-компьютер (ИМК) – системы, предназначенной для непосредственной передачи намерений человека внешним устройствам электрическими сигналами мозга, минуя естественную для этого мышечную активность. Важным прикладным аспектом этой проблемы является возможное использование ИМК для реабилитации больных, перенесших инсульт, в частности, в варианте инвазивного ИМК, требующего вживления микроэлектродов, или даже беспроводных систем отведения, в мозг человека. PHYSIOLOGICAL STUDIES ON MONKEYS: PRESENT AND FUTURE A. Grigoriev, I. Kozlovskaya, A. Badakva RF SSC – Institute of Biomedical Problems of the RAS After accomplishing of experiments on Macaca mulatta monkeys in 6 BION satellites’ flights which were directed to study of mechanisms of space flight factors’ effects on organism, the wide “on ground” model experiments on monkeys were turned over in IBMP. The aim of this program was to get the information on mechanisms of adaptation of organism in weightlessness, on the duration of its aftereffects and efficacy of countermeasure means and methods. The studies of the effects of simulated microgravity of physiological systems were carried out in 2 groups of monkeys (12 animals each) with the age of 3,5-5,0 years old and 4,5-7,0 kg of weight in the conditions of antiorthostatic bedrest (BR) and 9-days immersion. Automatic computerized testing system was used to monitor the mental capacity and psychoemotional state. Elaboration of compound instrumental reflex was performed in the situation of computer game. Monkey learns by itself to solve the visual task displayed on the screen, operating by its hand with a joystick, “striking” the target and getting the refreshment. The number of trials decreased almost to zero during the first three days in bedrest and immersion as well, i.e. the deep inhibition of playing motivation took place that testified to stress effect of experimental conditions on high nervous activity. Further the tendency to conditioned reflex activities’ recovery traced, however the initial level of motivation to game playing and successfulness of visual-motor task performance in the frame of optimal time interval recovered only after returning of monkeys in vivarium cages. Study of haematological state of monkeys showed that exposure to immersion and BR led to neutrophilic leukocytosis and lymphopenia after the first day of exposure, that point out to development of non-specific stress reaction. Histomorphological study of monkey iliac bone showed that immersion caused the development of osteopenia. Decrease of the volume of spongy bone tissue in ilium’s cristae was due to decline of bone trabecules’ thickness and decrease of their number, which caused the rarefaction of spongy substance and increase of the distance between trabecules. Velocity of atrophic changes’ development in ilium after immersion was much higher than that after bedrest. Exposure to immersion was followed by decrease of cross sectional area of postural and especially locomotor muscles. Reduction of the locomotor muscle’s size had the same intensity for fast and slow types of muscle fibres as well. Atrophic changes in slow type postural muscle fibres were deeper than in fast ones. M.Vastus lateralis fibre size changes were more expressed after dry immersion in comparison to bedrest. The study of influence of gravitational loads (GL) which were provided with the short-arm centrifuge rotation was carried out on 12 monkeys. Characteristics of blood circulation were examined by isotopic method; haematological and biochemical studies were carried out before BR and on the 28-th day of BR. Muscle biopsy was taken after BR accomplishing. It was shown the positive effect of gravitational loads on blood flow values in lower limbs; at the same time GL were followed by decrease of negative changes of protein metabolism observed in BR, which can be the evidence of deceleration of atrophic processes in skeletal muscles. Application of GL led to decrease of atrophic signs in both types of fibres in m.soleus and m. vastus lateralis. Therefore it was shown that use of gravitational loads in +Gz direction (head-pelvis) with the intensity of 1.2-1.6 G and duration up to 30 min 4-5 times per week can be effective in countermeasure of negative hypokinetic syndrome signs in monkeys. Currently in IBMP there is going wide studies on the development and application of brain-computer interface (BCI) – the system which is assigned to direct transfer of human’s intentions to external devices through electrical brain activity without the natural muscle activity. The important applied aspect of this work is the possibility of use of this technology for rehabilitation of stroke patients, particularly in the version of invasive BCI which requires microelectrodes’ or even wireless leads systems’ implantation into human brain. НИЗШИЕ ОБЕЗЬЯНЫ КАК ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ИЗУЧЕНИЯ ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА. Н.П.Гончаров, Г.В.Кация Эндокринологический научный центр, Москва. Россия Наши знания о функции эндокринной системы человека во многом основаны на данных, полученных в опытах на мелких лабораторных животных, гормональная деятельность желез внутренней секреции которых существенно отличается от таковой у человека. Для поиска альтернативной экспериментальной модели проведено всестороннее сравнительное исследование эндокринной функции стероид-секретирующих желез и механизмов её регуляции у различных видов низших обезьян. В результате этих исследований доказана перспективность использования павианов гамадрилов для решения в эксперименте широкого круга вопросов современной эндокринологии. Основные итоги этих многолетних исследований положены в основу данного доклада. Секреция стероидов надпочечниками обезьян. Изучение спектра стероидов синтезируемых в надпочечниках обезьян проводилось нами в опытах с канюлированием адреналовой вены, что обеспечило взятие крови оттекающей непосредственно от железы и прямое измерение скорости кровотока. У различных видов обезьян ( павианы гамадрилы, макаки резусы, красные обезьяны, зеленые мартышки) выявлено чрезвычайное сходство спектров секретируемых стероидов, но обнаружены и видовые различия в количественном соотношении между отдельными стероидами. Надпочечники обезьян в наибольшем количестве секретируют кортизол. Химическая структура 16 деленных стероидов была подтверждена методом инфракрасной спектрометрии. Биосинтез глюкокортикоидных гормонов у обезьян, как и у человека, происходит г преимущественно по ?5—пути. Иными словами, центральным звеном, на стадии которого происходит разветвление путей синтеза стероидов на 17—окси и I7—дезоксикортикостероиды является прегненолон. В таблице представлены показатели скорость секреции стероидных гормнов надпочечниками и семенниками у павианов гамадрилов. Для надпочечников павианов гамадрилов характерно выраженное преобладание секреции ?5-предшественников. Андростендион и дигидротестостерон имеют преимущественно надпочечниковое, а тестостерон - тестикулярное происхождение. Эстрон секретируется только надпочечниками, а эстрадиол семенниками. По величине отношения кортизола к кортикостерону наиболее близки к человеку павианы гамадрилы, у которых этот показатель достигает 10, тогда как у макак резусов он приближается к 20. Таблица. Скорость секреции стероидных гормонов ( M±SD) у самцов обезьян павианов гамадрилов Метаболизм стероидных гормонов Проведено сравнительное изучение метаболизма основных стероидов у человека и четырех видов обезьян (Павианы гамадрилы, макаки резусы, зеленые мартышки и красные обезьяны). Содержание неконъюгированных стероидов, а также их глюкуронидов и сульфатов определяли в суточной порции мочи с использованием методов хроматографического разделения. Идентификацию стероидов проводили с помощью микрометодов инфракрасной спектрографии и масс—спектрографии. Из экстрактов мочи обезьян были изолированы и идентифицированы 12 стероидных гормонов и их метаболитов. Позже была доказана экскреция с мочой обезьян 6 —гидрокситетрагидрокортизола, 2О?- и 20?-гидроксикортизона, а также кортолов и кортолонов и некоторых других стероидов. Все изолированные стероиды выделяются преимущественно в свободной форме и в виде глюкуронидов. Сульфатные формы С21-стероидов у обезьян, также как у человека экскретируются в незначительных количествах. Основными метаболитами кортикостероидов у обезьян и человека являются тетрагидропроизводные кортизола и кортизона, а также 20?-гкдроксикортизол. Содержание кортикостероидов в крови общей циркуляции. Наиболее доступным, а поэтому наиболее часто используемым способом оценки гормональной активности эндокринных желез является определение концентрации гормонов в периферической крови. С помощью радиоиииммунологических методов разработанных в лаборатории с предварительным хроматографическим выделением стероидов на целите мы провели сравнительную характеристику содержания кортикостероидов в периферической крови павианов гамадрилов и макаков резусов. Для большинства стероидных гормонов установлен четко выраженный биоритм их содержания на протяжении суток. Динамика концентрации кортизола и его предшественников у павианов гамадрилов и макак резусов, так же как у человека, характеризуется минимальными значениями во вторую половину дня с нарастанием концентрации до пиковых значений в ранние утренние часы. Наиболее близки к человеку по количественным параметрам макаки резусы и павианы гамадрилы, которые могут быть использованы в качестве наиболее адекватной модели при необходимости изучения в эксперименте метаболизма этой группы гормонов человека. Эндокринная функция половых желез у низших обезьян. На протяжении постнатального развития, до вступления обезьян в период пубертации половых различий в содержании тестостерона и эстрадиола в крови не наблюдается. Уровень эстрадиола в крови павианов гамадрилов обоих полов в возрасте 0,5 -3 лет составляет менее 0,06 нмоль/л, а тестостерона 0,7 — 1,0нмоль/л. В процессе полового созревания содержание тестостерона в крови самок не изменяется, а у самцов увеличивается в 20 раз. Уровень половых стероидных гормонов, характерный для взрослых животных устанавливается у самок павианов гамадрилов в 3, а у самцов в 4 года. Результаты наших экспериментов с одновременным канюлированием надпочечниковой, семенниковой, подвздошной вен и аорты позволили установить, что у половозрелых павианов тестостерон секретируется преимущественно семенниками, а дегидроэпиандростерон исключительно надпочечниками и используется семенниками для синтеза тестостерона. Гормональный контроль эндокринной функции клеток Лейдига семенников у обезьян осуществляет лютеинизирующий гормон ( ЛГ). Гипоталамическую регуляцию гонадотропной активности гипофиза контролирует люлиберин (рилизинг-фактор к лютеинизирующему гормону ЛРФ). У павианов гамадрилов введение 100 мкг синтетического люлиберина вызывает выраженный подъем концентрации биологически активного ЛГ. Так же как у мужчин максимальный подъем концентрации наблюдается через 30 мин после введения препарата и составляет у обезьян в среднем 400% . Эндокринная функция яичников низших обезьян. Пути и механизмы гормональной регуляции половых циклов у низших обезьян до конца еще не выяснены. Наиболее распространенной моделью для изучения в эксперименте вопросов женской репродуктивной эндо— кринологии являются макаки резусы. Благодаря исследованиям, проведенным в нашей лаборатории, было показано, что оптимальной альтернативной моделью являются самки павианов гамадрилов. У них длительность менструального цикла составляет в среднем 32 дня (24-38 дней) и отсутствуют сезонные колебания. Характер изменений содержания стероидных и лютеинизирующегогормонов в периферической крови в основном полностью повторяет динамику этих гормонов у женщин. Так же как для человека, у павианов наблюдается пик содержания эстрадиола, который регистрируется за день до пика лютеинизирующего гормона. Подъем уровня гестагенов (прогестерона и 2О?-дигидрогтрогестерона) начинается на следующий день после пика концентрации лютенизирующего гормона и достигает максимума на 7-ой день. Вместе с тем в отличие от человека и высших обезьян, у павианов гамадрилов и макаков резусов мы не обнаружили прегнандиола в моче, что указывает на иной путь метаболизма гормона желтого тела — прогестерона. Динамика стероидных гормонов и их предшественников в плазме крови беременных павианов гамадрилов Продолжительность беременности у павианов -180±7.1 дней. В начальный период беременности концентрация гестагенов выше, чем максимальная концентрация гормонов, наблюдаемая в лютеальную фазу цикла у небеременных самок. У павианов гамадрилов уровень гестагенов заметно нарастает во вторую половину беременности. К концу беременности содержание прогестерона в плазме превышает максимальные значения лютеальной фазы в 3.5 раза. Уровень эстрадиола и эстрона в плазме павианов в первой половине беременности повышается незначительно и только ,начиная с 80 дня беременности, как и у беременных женщин, происходит стремительное нарастание содержания эстрогенов, которое к концу второго триместра несколько снижается, а затем снова нарастает к концу беременности. Влияние стресса на функцию надпочечных и половых желез. Проблема экстремальных состояний и их влияние на гормональный статус представляет особую важность при проведении исследований в опытах на обезьянах. Сама экспериментальная процедура (взятие крови, измерение кровяного давления, осмотр животных, введение препаратов и т.д.) может являться для обезьян мощной стрессорной ситуацией и при анализе данных экспериментов необходимо детально знать, какие именно гормональные сдвиги обусловлены сопутствующей эксперименту стрессорной ситуацией. У павианов гамадрилов двухчасовая иммобилизация, которая является сильнейшим нейро—эмоциональным раздражителем, вызывает активацию надпочечниковой секреции кортизола и его предшественников. Максимальное увеличение уровня кортизола через 2—4 часа после начала иммобилизации составляет 70—80%,а его предшественников 200—500%. Резкий выброс стероидов сопровождается снижением их концентрации в последующие трое суток. У неполовозрелых самцов в условиях аналогичного стрессорного воздействия уровень кортизола не увеличивается, концентрация его предшественников значительно снижается, а содержание тестостерона и 5?—дигидро-тестостерона в плазме периферической крови не изменяется. У самок павианов гамадрилов реакция яичников на стресс определяется фазой менструального цикла, то есть, исходным функциональным состоянием системы гипофиз—гонады. В фолликулярную фазу стресс подавляет концентрацию эстрадиола и эстрона, а в лютеальную — прогестерона и 20?- дигидропрогестерона. Уровень гормонов снижается в среднем на 50% через 2—4 часа после начала действия стрессорных факторов и длительность эффекта составляет 48 часов. Итак, стрессорные факторы наряду с активацией функции надпочечных желез, вызывают глубокое и длительное подавление эндокринной функции гонад, что, по-видимому, определяет их роль в патогенезе многочисленных нарушений репродуктивной функции человека. Таким образом, мы рассмотрели практически все основные параметры деятельности системы гипофиз—надпочечники-гонады у самцов и самок низших обезьян, проанализировали их сходство и различие с человеком. Приведенные результаты достаточно убедительно обосновывает преимущество использования низших обезьян, особенно павианов гамадрилов, в качестве адекватной модели для изучения в эксперименте эндокринной функции надпочечных и половых желез, механизмов их гормонального контроля в норме и патологии. Знание физиологии стероидсекретирующих желез обезьян позволило провести уникальные эксперименты в рамках программы Института Медико-биологических Проблем и ИЭПиТ АМН СССР по изучению их гормональной функции в условиях длительной клиностатической гипокинезии, которая сопровождалась существенными нарушениями гормонального гомеостаза, как у самцов, так и у самок. Выполнены пионерские исследования по испытанию гормональных препаратов на репродуктивную функцию обезьян, с последующим выходом двух препаратов – пролонгированных эфиров тестостерона и нового гестагена в широкую клиническую практику. Их производство организовала фирма Йена-Фарм, с которой ИЭПиТ сотрудничал на протяжении многих лет. Выяснен важный эффект экзогенного дегидроэпиандростерона, который в физиологических дозах обеспечивает ускорение полового созревания у обезьян. А введение антагониста тестостерона ципростерон-ацетата самцам павианов при групповом содержании сопровождается перераспределением их иерархической соподчиненности. Директор ИЭПиТ Б.А.Лапин является организатором исследований по сравнительному изучению эндокринной системы низших обезьян и человека. Это произошло в 1961 г, когда он пригласил одного из авторов представленного доклада работать в Сухумском Приматологическом Центре. Однако ради справедливости необходимо сказать о том, что пионером по изучению у обезьян антропометрических параметров и их связи с величиной экскреции 17-кетостероидов была Л.В. Алексеева. К нашему счастью Б.А.Лапин хорошо понимал значение международного сотрудничества по использованию обезьян для выполнения различных исследований, включая и эндокринологию. Исключительно плодотворное сотрудничество с ведущей Европейской группой в области биохимии стероидов, которую возглавлял проф. К.Шуберт (ГДР, Йена), с проф. Е.Дисфалузи в области репродуктивной эндокринологии (Каролинский институт, Стокгольм, Швеция и проф. В Стивенсон (Каламбос, США). Сотрудники лаборатории выезжали в длительные командировки для выполнения конкретных проектов и освоения новых технологий. Позже лаборатория экспериментальной эндокринологии была включена в выполнение ряда исследований по Программе репродукция человека ВОЗ (Женева) ВОЗ финансировал закупку необходимого оборудования, что обеспечило организацию первоклассной лаборатории. Такие методический возможности лаборатории позволяли проводить исследования на самом высоком уровне, краткое изложение результатов выполненных исследований и представлены в данной работе, посвященных мудрому , достопочтенному юбиляру Б.А.Лапину. В работе лаборатории принимали активное участие наши незаменимые младшие коллеги: Л.Хагундокова, Н.Пачалия, В.Шитова, Л.Ломая, Л.Узарашвили, Н. Папандопуло , Л.Заридзе, М.Шарикова, главный инженер В.Г.Сатула и многочисленные сотрудники питомника обезьян. Соавторы и их диссертации по материалам представленных исследований: Н.П.Гончаров, д.м.н. « Функция коры надпочечников у низших обезьян в норме и при некоторых патологических состояниях», 1971г. В.И.Воронцов, к.м.н. «Характеристика метаболизма кортикостероидов у низших обезьян в норме и в условиях стресса», 1972 г. А.Г.Таранов, к.б.н. «Биологические ритмы гормональной функции надпочечниковых и половых желез у самцов павианов гамадрилов и характер их изменения в условиях стресса», 1981 г. В.М. Горлушкин, к.б.н. «Характеристика гормональной функции стерид-продуцирующих желез у самок павианов гамадрилов в норме и в условиях экстремальных воздействий», 1981 г. Д.С.Тавадян, к.м.н.«Гормональная функция надпочечниковых и половых желез самцов макаков резусов при длительной гипокинезии», 1981 г. Т.Н.Тодуа, к.м.н. «Гормональная функция гипофизарно-адреналовой системы у гонадэктомированных самок павианов гамадрилов», 1988 г. И.Н.Чигогидзе, к.б.н. «Характеристика стероидогенеза при беременности у обезьян павианов гамадрилов в норме и в условиях экстремальных воздействи», 1989 г. Г.В.Кация, д.м.н. «Характеристика адрено-гонадальных взаимосвязей у приматов», 1991 г. В.Ю.Бутнев д.м.н. «Гормональная функция стероидпродуцирующих желез приматов в постнатальном онтогенезе», 1995 г. «ИСПЫТАНИЕ НА ПРИМАТАХ ЭФФЕКТИВНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ» NEUROMAPS: A WEB-BASED IMAGE PROCESSOR FOR MACAQUE BRAIN PATHOMORPHOLOGY Douglas M. Bowden1, Mark Dubach, and Eider Moore National Primate Research Center and Dept. of Psychiatry and Behavioral Sciences University of Washington, Seattle, USA INTRODUCTION The results of many studies in neuropathology are best reported by illustrations. Often, however, one finds figures in the literature that are considerably less informative than they might be (Fig. 1). We are addressing that problem by putting on the World Wide Web a set of image processing tools that enable neuropathologists to produce figures of highest quality for publication and presentation of findings. Figure 1: Hand-drawn Figures from studies of the macaque brain; (A) distribution of cells stained for tyrosine hydroxylase (TH) in prefrontal cortex; (B) lesion of right lateral prefrontal cortex. The set of tools we have created so far is now available in NeuroMaps, the brain atlas component of the BrainInfo website. Scientists throughout the world have access to it at: http://braininfo.org. METHODS The image processor of NeuroMaps, involves two components: a 3-dimensional digital Atlas of the macaque brain, which the user can cut, tilt, rotate and size to match an experimental image, and Mapper software, which allows the user to warp data from an experimental image (Fig. 1) to the Atlas image (Fig. 2) for publication or presentation. The Macaque Brain Atlas is based on a magnetic resonance image (MRI) of the brain of a young male rhesus macaque (Macaca mulatta) of an age and size most commonly studied in neuroscientific research (3kg). The brain specimen was obtained from the Research Institute of Medical Primatology, Sochi-Adler, Russia, where it was fixed by perfusion and immersion in 4% paraformaldehyde-saline solution. MR images were obtained at the Martinos Center, a radiological facility of Harvard University (4.7 Tesla, T2 weighted, 150mu isotropic voxels and spin echo DTI, 450mu isotropic voxels, 20 directions). The T2-weighted MRI was segmented into some 550 primary structures using NeuroMaps Tracer software. The NeuroMaps Mapper, Tracer and Image Processor software was programmed in Java to perform the functions described in the following section. RESULTS The NeuroMaps Atlas is designed to accept any kind of data that can be displayed on a surface view or cross-sectional view of the brain. That includes pathological or surgical lesions (Fig. 1B), electrode stimulation and recording sites, stains for enzymes (Fig. 1A), neurotransmitters, receptors, cell types, and gene expression. The user proceeds through the following steps: * Loads a digital image of a slide or drawing into the right panel of the NeuroMaps display (Fig. 2); * Loads the Atlas into the left panel; * Selects an Atlas view that matches grossly the experimental image (surface or cross-sectional view); * If a cross-sectional view, the user adjusts the plane of section of the MRI forward and backward to match that of the experimental image; * Tilts and rotates the MRI to further match that of the experimental image; * Adjusts the sizes of the Atlas and experimental images to match; * Clicks pairs of landmark points that are visible in both the Atlas and the experimental image; the Mapper will use these to register the experimental image to the Atlas. * Clicks a button labeled ‘Map It!’, which instructs the Mapper to perform a nonlinear transformation of the experimental image to the Atlas. * Clicks data points, as in Fig. 1A, or uses the cursor to draw boundaries of areal data, as in Fig. 1B, to create data overlays on the Atlas. * Assigns labels to the data overlays * Transfers the Atlas image with overlays into the Image Processor * Edits the image by adjusting colors and labels of overlays * Downloads the edited image for presentation or publication (Fig. 3) DISCUSSION AND PLANS The illustrations generated by the NeuroMaps Image Processor shown in Fig. 3 show how mapping to a standard segmented atlas can add value to the experimental image. Figure 3(left) left provides labels that identify the gyri of the prefrontal cortex where TH staining cells are located. Furthermore, it shows clearly that the cells are distributed in both the cortex and subcortical white matter at their interface. This potentially important information was not obvious in the original image. Figure 3(right) provides labels that identify the gyri involved in the lesion and, by showing the lesion on a three-dimensional model, clarifies that the preserved tissue, indicated by an empty area on the ventral surface of the frontal pole, is medial orbital cortex, not a lateral gyrus. * Figure 2: NeuroMaps Display An experimental image, in this case a page from a published atlas of the rhesus macaque brain, has been loaded into the panel on the right. The NeuroMaps Atlas of the macaque brain is loaded into the panel on the left. The slider circled in the sidebar on the right is used to move the plane of section of the Atlas forward and backward in the MRI to match the plane of section of the experimental image. The circled ‘pie’ icon is used to tilt and rotate the plane of section of the MRI to further match that of the experimental image. Figure 3: Illustrations Produced by NeuroMaps Image Processor based (left) on point data representing TH-positive neurons (Fig. 1A) and (right) We envision two valuable extensions of NeuroMaps to further assist a user who has mapped data to the Atlas. First heshould be able to correlate his data with all other data mapped to the same areas. We intend to program NeuroMaps to identify the structures where the data are located and to provide quantitative information about the overlap between the user’s data set and data mapped by others. For example, the user who mapped the location of TH-containing cells in Fig. 2A will be informed of other kinds of cells found in the same region, genes expressed there, etc. The user who mapped the lesion to the prefrontal cortex in Fig. 2B could discover the architectonic areas reported by neuroanatomists to be in that location, the behavioral results of electrical stimulation there, etc. ОЦЕНКА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТОВ В КАПСУЛАХ В ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЯХ НА ОБЕЗЬЯНАХ Лапин Б.А.*, Давыдкин В.Ю.**, Афанасьев С.С.**, Джикидзе Э.К.*, Мелихова А.В.**, Кебу Т.И.*, Егорова Т. П.*, Давыдкин И.Ю.**, Холодилова Л.И.*, Ардашелия С.Н.* * НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия ** МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва, Россия В работах ряда авторов [1,2], а также наших предыдущих публикациях [3,4] отмечалось, что вследствие сходства количественного и качественного состава нормофлоры кишечника, причин и механизмов развития дисбактериозов у приматов и человека, обезьяны являются лучшей биосистемой для оценки безвредности и эффективности препаратов, разрабатываемых для профилактики и терапии заболеваний, ассоциированных с дисбалансом микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Исходя из этого, с 2001 года в НИИ МП РАМН были проведены доклинические испытания разработанных и приготовленных в лаборатории медицинской биотехнологии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского 15 новых препаратов в различных лекарственных формах (таблетки, капсулы, растворы и суспензии для приема внутрь), а также кишечнорастворимого пленочного покрытия для твердых дозированных форм с использованием более 250 узконосых обезьян семейства мартышковых (макак резус, макак яванский и макак лапундер). Целью настоящего исследования являлась оценка терапевтической эффективности иммунобиологических препаратов при острых кишечных инфекциях (ОКИ) у обезьян. Для изучения терапевтической эффективности препаратов из болеющих ОКИ с диарейным синдромом [5] обезьян вида макак резус и макак яванский было сформировано 4 группы общей численностью 31 обезьяна в возрасте от 1,1 до 20 лет весом 1,0-9,5 кг. Диарейный синдром – частый жидкий стул со зловонным запахом без патологической примеси от 6 до 8 раз в сутки, умеренная сниженная активность. Состояние обезьян оценивалось как среднетяжелое. Для лечения использовали следующие препараты: Группа I (опытная) получала комбинированный биопрепарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 0,4 г препарата: 85 мг комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), 8,5?106 КОЕ бифидобактерий B. adolescentis МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила. Группа II (опытная) получала лиофилизированный комплексный иммуноглобулиновый препарат в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 150 мг КИП со специфической (антисальмонеллезной) активностью не ниже 1:320 в титрах РПГА. Группа III (опытная) получала лиофилизированные бифидобактерии в твердых желатиновых капсулах № 1. Каждая капсула содержала 2,3?109 КОЕ B. adolescentis МС-42. Группа IV (контрольная) получала офлоксацин (субстанция) в капсулах в дозе 0,3 г. Животным групп I и II давали по 2 капсулы, а групп III и IV – по 1 капсуле в день. Все препараты вводили через рот натощак в течение 7 дней по отработанной методике [6]. На фоне основной терапии проводили антигельминтное и антипаразитарное лечение против балантидий и лямблий, для чего вводили ивомек (или иверек) однократно из расчёта 0,1 мл/1 кг веса внутримышечно и метронид из расчёта 0,2 мл/1 кг веса внутримышечно два раза с интервалом в 48 часов. Наблюдение за животными продолжалось в течение 2-3 недель. Проводилось бактериологическое и паразитологическое исследование фекалий до, и после окончания лечения. Кровь из локтевой вены брали до и после окончания лечения в объёме 10 мл для определения печёночных ферментов. Осуществлялось динамическое отслеживание клинических проявлений и состояния животного (внешний вид, поза, активность, аппетит, агрессивность, частота и характер стула - ежедневно в процессе лечения и после его окончания в течение 7 дней). Взвешивали обезьян до, после окончания лечения и перед выпиской из клиники. Группа I (7 обезьян вида макак резус). Клинические проявления (частый жидкий стул) у двух обезьян наблюдали в течение 4 дней, у трех - до 5 дней, у одной нормализация стула наступила с 7 дня и у одной обезьяны - с 10 дня. Средняя длительность периода полной нормализации стула и выздоровления - 6,4 дней. Патогенные представители энтеробактерий у животных данной группы не были обнаружены. В кишечной микробиоте 5 исследованных обезьян наблюдались следующие изменения. Содержание бифидобактерий, составлявшее перед началом лечения 108-1010 КОЕ/г, по окончании срока наблюдения (14 дней) существенно не изменилось. Суммарное количество кокковых форм снизилось с 15-40% до 6-16%. На 1-2 порядка возросло количество нормальных представителей E. coli. На 3-6 порядков снизилось количество Staph. epidermidis, на 2-4 порядка – Enterococcus spp. Концентрация микроорганизмов рода Proteus у двух обезьян осталась без изменений, у одной - снизилась на 3 порядка, у двух обезьян достигнута полная элиминация. Количество Klebsiella spp. у одной обезьяны снизилось на 4 порядка, у одной - на 3, у трех обезьян - полностью элиминированы. Полностью выведены энтеробактерии у четырех обезьян, а представители Citrobacter - у пяти животных. Группа II (8 макак резус и 2 макак яванский). Диарейный синдром (жидкий неустойчивый стул) 1-7 дней, нормализация наступала со 2 дня. У четырех особей нормализация стула произошла со 2 дня, у одной - с 3 дня, у трех - с 8 дня, у одной - с 9 дня и еще у одной - с 10 дня. Средняя длительность периода нормализации стула - 5,4 дней. Патогенные представители энтеробактерий у макаков резус данной группы не были обнаружены. У макака яванского (самец) выявлена Sh. flexneri-4a в количестве 10 КОЕ/г. В кишечной микробиоте обезьян регистрировались следующие изменения. Содержание бифидобактерий, составлявшее перед началом лечения 107-109 КОЕ/г, существенно не изменилось. Количество нормальных представителей E. coli возросло на 1-3 порядка. На 2-4 порядков снизилось количество Staph. epidermidis, на 1-3 порядков – Enterococcus spp. Концентрация микроорганизмов рода Proteus у двух обезьян осталась без изменений, у одной - снизилась на 1 порядок, у двух обезьян возросла на 3 порядка. При повторном бактериологическом исследовании после окончания лечения возбудитель дизентерии у макака яванского не обнаружен. Группа III (7 макак резус). Клинические проявления у одной обезьяны наблюдали в течение 3 дней, у одной - до 7 дней, у двух нормализация стула наступила с 10 дня и у одной обезьяны - с 12 дня. У двух самок нормализация стула была достигнута с 15 дня без долечивания офлоксацином. Средняя длительность периода полной нормализации стула и выздоровления - 11,4 дней. Патогенные представители энтеробактерий у животных данной группы не были обнаружены. После лечения количество бифидобактерий с 107-108 возросло у всех пяти обезьян до 1010 КОЕ/г. Содержание нормальной кишечной палочки увеличилось на 1-2 порядка на фоне снижения количества слабоферментирующей. Количество эпидермального стафилококка, энтерококков, клебсиелл и клостридий не изменилось. Стрептококки элиминированы у четырех обезьян, у одной - их содержание осталось без изменения (107). Количество микроорганизмов рода Proteus у одной обезьяны не изменилось (104), у одной – снизилось на 2 порядка, у трех – элиминированы. Группа IV (7 макак яванский). Диарейный синдром 7-10 дней. Нормализация стула наступила у двух особей с 6 дня, у одной - с 7 дня, у одной - с 8 дня, еще у двух стул нормализовался с 11 дня и у последней – с 13 дня. Средняя длительность периода полной нормализации стула и выздоровления – 8,9 дней. Патогенные энтеробактерии у обезьян этой группы обнаружены не были. Дисбиотические изменения микрофлоры ЖКТ приматов были слабо выражены. После антибиотикотерапии количество бифидобактерий снизилось на порядок до 109 КОЕ/г. Содержание нормальной кишечной палочки выросло на 1-3 порядка. Количество эпидермального стафилококка и энтерококков оставалось практически без изменений. Представителей других видов условно-патогенных микроорганизмов выявлено не было. В результате проведения исследований установлено также, что по окончании срока наблюдения яйца глист и патогенные простейшие не выявлены ни у одной обезьяны. Содержание у всех обезьян печеночных ферментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы не выходило за пределы физиологической нормы. Вес животных в процессе лечения также колебался в пределах физиологической нормы. Обработка результатов исследований с помощью непараметрического критерия Мэнн-Уитнея [7] по длительности клинических проявлений ОКИ при уровне достоверности 95% показала следующее. При сопоставлении групп I и II различие средних характеристик этих групп по принятому параметру отсутствует ({Uр=24,5} ? {Uт=15}). При сопоставлении групп I и III ({Uр=9} ? {Uт=11}), I и IV ({Uр=9,5} ? {Uт=11}) при том же уровне достоверности различие средних характеристик сравниваемых групп по длительности клинических проявлений болезни у обезьян доказано. При сопоставлении групп II и III ({Uр=9,5} ? {Uт=17}), II и IV ({Uр=16,5} ? {Uт=17}) при том же уровне достоверности различие средних характеристик сравниваемых групп по принятому параметру доказано. При сопоставлении групп III и IV ({Uр=17,5} ? {Uт=11}) достоверного различия средних характеристик этих групп по длительности клинических проявлений ОКИ нет. Следовательно, комбинированный биопрепарат в твердых желатиновых капсулах (85 мг КИП, 8,5?106 КОЕ бифидобактерий B. adolescentis МС-42, 0,28 г основной окиси алюминия и аэросила) при лечении острой кишечной инфекции обезьян обладал одинаковой терапевтической эффективностью с капсулами комплексного иммуноглобулинового препарата (150 мг КИП) и большей эффективностью, чем капсулы B. adolescentis МС-42 (2,3?109 КОЕ бифидобактерий) и офлоксацин в капсулах по 0,3 г. При этом достоверных различий в эффективности лечения диареи бифидобактериями и антибиотиком нет. Следует обратить внимание, что высокий терапевтический эффект от применения комбинированного биопрепарата был получен при том, что суточная доза его (2 капсулы) содержала КИП примерно в два раза меньше, чем в монопрепарате КИП (2 капсулы), и бифидобактерий B. adolescentis МС-42 на два порядка меньше, чем в капсулах соответствующего монопрепарата (1 капсула). Применение комплексного иммуноглобулинового препарата сопровождалось более выраженными положительными изменениями в микробиоценозе ЖКТ обезьян, чем использование B. adolescentis МС-42. Максимальный в описываемых экспериментах эффект нормализации кишечной микрофлоры был достигнут при лечении обезьян комбинированным биопрепаратом, содержащим КИП, бифидобактерии и окись алюминия. При этом существенно снижалось количество таких условно-патогенных микроорганизмов, как Staph. epidermidis, представителей родов Enterococcus, Proteus, Klebsiella, и были полностью элиминированы представители Citrobacter. Нормализация клинических показателей носила необратимый характер - не было ни одного случая рецидива заболевания при лечении приматов комбинированным препаратом. Таким образом, терапевтическая эффективность всех иммунобиологических препаратов была выше или сопоставима с эффективностью лечения офлоксацином. В целом результаты проведенных исследований являются дополнительным подтверждением адекватности обезьян наиболее близкой к человеку биологической модели для доклинического изучения разрабатываемых биопрепаратов. Литература. 1. Получение комплексных иммуноглобулиновых препаратов (КИП) для парентерального и энтерального применения / И.В. Борисова, Н.В. Холчев, В.В. Поспелова, Э.К. Джикидзе // В кн.: Иммуноглобулины и другие препараты крови. – Горький: Горьковский мед. инст. им. С.М. Кирова, 1986. – С. 69-73. 2. Природа протективного фактора рибосомальной шигеллезной вакцины / В.И. Левенсон, Т.П. Егорова, Э.К. Джикидзе, З.П. Белкин, З.К. Стасилевич, В.Г. Федосова // Сборник материалов всесоюзной конференции «Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии», 27-30 октября 1987 г. – Сухуми, 1987. – С. 79. 3. Оценка на обезьянах реактогенности и эффективности лекарственных форм комплексного иммуноглобулинового препарата / Б.А. Лапин, В.А. Алешкин, В.Ю. Давыдкин, А.А. Воробьев, Э.К. Джикидзе, С.С. Афанасьев, З.К. Стасилевич, Т.И. Кебу, И.Ю. Давыдкин, И.В. Борисова, Т.Е. Гвоздик, В.А. Калашникова, А.Г. Гаврин, А.В. Зорик, Л.И. Новикова // Журнал микробиологии. - №3. – 2003. – С. 57-62. 4. Изучение иммунобиологических препаратов на обезьянах / В.А. Алешкин, Б.А. Лапин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова, Э.К. Джикидзе, В.Ю. Давыдкин, И.Ю. Давыдкин, Т.И. Кебу, Т.Е. Гвоздик // Материалы Всероссийской научной конференции «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях», 8-10 августа 2006 г. в Сочи-Адлер. – Сочи-Адлер, 2006. – С. 49-54. 5. Проблемы инфекционной патологии обезьян / Б.А. Лапин, Э.К. Джикидзе, Р.И. Крылова, З.К. Стасилевич, Л.А. Яковлева // М.: Издательство РАМН, 2004. – С. 48-49. 6. Патент 2317065 RU, МПК А61К 6/00. Способ определения целевой доставки в желудочно-кишечном тракте твердой лекарственной формы с защитным покрытием / Алешкин В.А., Лапин Б.А., Давыдкин В.Ю., Джикидзе Э.К., Мелихова А.В., Симавонян К.В., Рубальский О.В., Давыдкин И.Ю. (RU). - №2006142791/14; Заявл. 05.12.2006; Опубл. 20.02.2008, Бюл. № 5. – 4 с. 7. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. – Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1975. – 77 с. EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFICIENCY OF BIOPREPARATIONS CAPSULES IN PRE-CLINICAL TESTS ON MONKEYS Lapin B.A.*, Davydkin V.Yu.**,Afanasiev S S **, Dzhikidze E.K.*, Melikhova A.V.**, Kebu T.I.*, Egorova T.P.*, Davydkin I.Yu.**, Kholodilova L.I.*, Ardasheliya S.N.* *Research Institute of Medical Primatology RAMS, Sochi, Russia **G.N.Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia The purpose of this study was to assess the therapeutic efficacy of immunobiological drugs in acute intestinal infections (DCI) in monkeys. From sick monkeys of M. mulatta (rhesus) and M. fascicularis 4 groups were formed totalling 31 monkey at the age from 1.1.to 20 years old. Weight of monkeys varied from 1.0 to 9.5 kg. Diarrheic syndrome – frequent liquid stool with smelly odor without pathological admixtures from 6 to 8 times a day, moderately reduced activity. The monkeys were assessed as moderate. Drugs for treatment of primates were used in hard gelatinous capsules # 1: Group I (experimental) - combined preparation. Each capsule contains 0.4 g: 85 mg integrated immunoglobulin (TRC), 8.5?106 CFU Bifidobacterium adolescentis MC-42, 0.28 g a?rosil and aluminium oxide. Group II (experimental) - freeze dried integrated immunoglobulin (150 mg with a specific activity is below 1: 320 credited RPGA). Group III (experimental) - freeze dried bifidobacteria (2.3?109 CFU B. adolescentis MC-42). Group IV (control) - ofloxacin dose 0.3 g. Animals in groups I and II were given to 2 capsules, and in groups III and IV-1 capsule per day. All drugs administrated per os on an empty stomach for 7 days for diarrhea treatment. The average duration of full normalization and recovery of monkeys are as follows: group I - 6.4, group II - 5.4, group III - 11.4 and group IV - 8.9 days. Processing the results of research using non-parametric Mann-Witney test for duration of clinical manifestations of the DCI at confidence level 95% showed no differences between groups I and II, III and IV. But when comparing the groups I and II with groups III and IV found credible difference in timing recovery of monkeys. Immunoglobulin preparation was accompanied by a comprehensive larger positive changes in mikrobiocenoze of intestinal tract of monkeys than B. adolescentis MC-42. The maximum effect in the normalization of intestinal microflora had been made in treating monkeys combined preparation. Thus, therapeutic efficiency of immunobiological preparations was higher than or comparable to the effectiveness of treatment of ofloxacin. In general studies are further confirmation of adequacy of monkeys the closest to man a biological model for pre-clinical study elaborated biopreparations. ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНА ДЛЯ ТЕРАПИИ И ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИМАТОВ Ф.И.Ершов Известно, что оспа, полиомиелит, ОРВИ, герпес, гепатит и многие другие вирусные инфекции по этиологии, патогенезу и клинической картине чрезвычайно близки, если не идентичны у человека и приматов. Это, естественно сделало возможным использование для профилактики и терапии одних и тех же этиотропных, иммуномодулирующих, патогенетических и симптоматических препаратов. Однако до сих пор далеко не все препараты, которые эффективны для людей, применяются у приматов. Это, в первую очередь, относится к группе индукторов интерферона (ИИ). Создание новой перспективной группы антивирусных препаратов, относящихся к индукторам эндогенного ИФН, органично дополняет начатое ранее использование в приматологии экзогенных ИФН. Подобный альтернативный подход существенно расширяет возможности интерферонотерапии. В результате многолетнего целенаправленного скрининга отечественным исследователям удалось выявить несколько весьма перспективных для медицины ИИ, имеющих высокий химиотерапевтический индекс и пригодных для профилактики и лечения вирусных инфекций и ряда других заболеваний (таблица 1 ). Изучение эффективности отобранных индукторов при различных экспериментальных вирусных инфекциях выявило спектр активности этих препаратов и позволило наметить основные пути их дальнейшего клинического применения. Полученные результаты показали бифункциональность ИИ. Они обладают широким диапазоном антивирусной активности (этиотропный эффект) и выраженными иммуномодулирующими свойствами. Таблица 1 Индукторы ИФН Химическая природа Препарат (коммерческое название) А. Синтетические соединения 1. Низкомолекулярные: флуореноны, акриданоны. Амиксин, циклоферон, неовир 2. Полимеры (дсРНК): поли(А) поли(У); поли(И) поли(Ц) Полудан Б. Природные соединения 1. Полифенолы Мегосин, кагоцел, саврац 2. Полимеры (дсРНК) Ларифан, ридостин Широкое системное использование ИИ различной природы показало, что их активность совпадает с ранее выявленной активностью экзогенных интерферонов. При введении в организм они вызывают ряд эффектов, которые связаны с ингибированием роста клеток, модуляцией их дифференцировки и синтезом мембранных рецепторов, а также с действием на различные звенья системы иммунитета. Как и при действии ИФН, это выражается в активации макрофагов, цитотоксических Т-клеток,атителообразующих В-клеток, естественных киллеров и др. Действие ИИ осуществляется в комплексе с другими медиаторами воспалительных и иммунных ответов (цитокинов), а также совместно с гормонами и нейромедиаторами. Индукторы ИФН, обладая теми же иммуномодулирующими свойствами, что и собственно ИФН, стимулируют пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга, используя механизмы врожденного и адаптивного иммунитета. Известно, что одним из свойств ИИ является создание в организме длительной антивирусной резистентности, которая не может быть объяснена только действием эндогенного ИФН, синтезированного в ответ на введение индуктора, т.к. ИФН выводится из организма гораздо раньше. По-видимому, она является следствием непосредственного влияния ИИ на клеточный и гуморальный иммунитет, что требует дальнейшего изучения. Основные достоинства отобранных индукторов интерферона * они не обладают антигенностью; * синтез ИФН при введении индукторов сбалансирован и контролируется организмом, что предотвращает побочные эффекты, наблюдаемые при передозировке; * даже однократное введение индукторов, приводит к длительной продукции ИФН в терапевтических дозах, ; * Наконец, некоторые ИИ обладают уникальной способностью "включать" синтез ИФН в определенных популяциях клеток и органов. Десятилетний опыт клинического использования ИИ демонстрирует безусловную медицинскую значимость этого нового поколения препаратов, эффективных для профилактики и лечения широкого ряда острых и хронических вирусных инфекций (таблица 2). Основным достоинством ИИ является универсально широкий спектр антивирусной активности, связанный, главным образом, с их способностью "включать" синтез эндогенных ИФН - важнейших факторов естественного (врожденного) иммунитета. Помимо этиотропного действия ИИ обладают выраженными иммунокоррегирующими эффектами, позволяющими использовать их для терапии заболеваний невирусной этиологии. Таблица 2 Клиническое применение индукторов интерферона Название препарата Клинические показания Амиксин Герпес, вирусные гепатиты, энтеровирусные инфекции, грипп и др. ОРВИ, бактериальные заболевания Кагоцел Грипп и др. ОРВИ, генитальный герпес Ларифан Грипп и др. ОРВИ, различные формы герпеса (генитальный, офтальмогерпес, опоясывающий), гепатит В Мегосин Герпес 1 и 2 типа, опоясывающий лишай Неовир Герпесвирусные инфекции, острый вирусный гепатит А, хронические вирусные гепатиты В и С, грипп и др. ОРВИ Полудан Герпетический кератит и кератоконьюктивит Ридостин Арбовирусные инфекции, герпес, хламидиоз Циклоферон Гепатит, герпес, ВИЧ-инфекция, хламидиоз Совокупность всех полученных данных, позволяют рекомендовать индукторы интерферона для терапии вирусных болезней приматов. Литература 1. Ершов Ф.И. – Система интерферона в норме и при патологии. – М.: "Медицина", 1996, 238 с. 2. Ершов Ф.И. – Антивирусные препараты. – М.: "Медицина", 2006г.г.,300с.. 3. Ершов Ф.И. – Этиотропная терапия наиболее распространенных вирусных инфекций. – "Вестник РАМН", 2001, № 11, с. 34-39. 4. Ершов Ф.И. – Медицинская значимость интерферонов и их индукторов. – "Вестник РАМН", 2004, № 2, с. 9-13. 5. Ершов Ф.И., Коваленко А.Л., Романцов М.Г., Голубев С.Ю. – Циклоферон. Клиническая фармакология и терапия. – СПб, 1998, 108с. 6. Ершов Ф.И., Малиновская В.В. – Иммуномодуляторы в профилактике и терапии вирусных инфекций. – ЖМЭИ, 1996, № 3, с. 122-125. 7. Ершов Ф.И., Новохатский А.С. – Интерферон и его индукторы. – М.: "Медицина", 1980, 173с. 8. Ершов Ф.И., Тазулахова Э.Б. – Индукторы интерферона – новое поколение иммуномодуляторов. – "Вестник РАМН", 1999, № 4, стр. 52-56. СТЕНДОВЫЕ ДОКЛАДЫ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ H5N1 ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ С УДАЛЕННОЙ NS1 ОТКРЫТОЙ РАМКОЙ СЧИТЫВАНИЯ НА МОДЕЛИ ЯВАНСКИХ МАКАК (MACACA FASCICULARIS) Е.А. Романовская-Романько*, B. Ferko***, О.И. Вышемирский**, Ю.Р.Романова*,***, М.П. Грудинин*, Б.А. Лапин**, А.Ю.Егоров*,***, О.И. Киселев* * ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, лаборатория молекулярной вирусологии и генной инженерии, Санкт-Петербург; ** НИИ медицинской приматологии РАМН, лаборатория инфекционной вирусологии, Сочи; *** Компания АВИР ГринХилзБиотехнология АГ, Вена. Циркуляция высоко патогенных вирусов гриппа А H5N1 среди птиц, с периодическими инфекциями людей, продолжается с 1997 года. Высокий уровень смертности (?60%) и появление нескольких различных клайдов внутри субтипа H5N1 вирусов обусловили необходимость создания эффективной вакцины для предотвращения потенциальной пандемии, вызванной вирусами «птичьего гриппа». В последнее время во многих исследованиях была показана возможность и перспективность использования рекомбинантных вирусов, с усеченными или содержащими мутации NS1 белками, в качестве живых-аттенуированных противовирусных вакцин . Подобные вакцинные штаммы получают с помощью методов «обратной генетики» и предназначены для интраназального применения. Вирусные штаммы за счет нарушения основной функции полноразмерного NS1 белка, как антагониста системы интерферонов I типа, теряют способность к полноценной репликации в организме хозяина, но могут реплицироваться до высоких титров на соответствующих ИФН-дефицитных системах, таких как клетки Vero, что обеспечивает эффективное производство вакцины на культуре клеток . Отсутствие целого гена NS1 обеспечивает генетическую стабильность и высокий уровень безопасности вакцины, сравнимой с инактивированными гриппозными вакцинами. Кроме того, вирусы с усеченным NS1 сохраняют иммуногенность и вызывают антительный и клеточный иммунный ответ . Поскольку ранее было показано, что приматы видов Macaca mulatta и Macaca fascicularis являются подходящей моделью для оценки патогенеза вирусов гриппа H5N1 (Rimmelzwaan et al.,2001; Fan et al.,2009), в данном исследовании на модели яванских макак была проведена оценка безопасности и иммуногенности H5N1 рекомбинантого вакцинного штамма с удаленным NS1 cегментом генома (VN1203delNS1). Яванские макаки имеют сходное с человеком распределение сиаловых рецепторов в респираторном тракте. В частности, известно, что на слизистой ткани трахеи макак имеются рецепторы, сходные с человеческими, а в альвеолах этих животных расположены рецепторы, сходные с птичьими . Поэтому при использовании данной модели животных была возможность определить эффективность интраназальной иммунизации с использованием вирусов H5N1, специфичных к рецепторам птиц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клетки и вирусы. В работе использовали культуру клеток Vero (Европейская Коллекция Клеточных Культур), адаптированную к росту в бессывороточной среде. Вирусные штаммы были получены методом «обратной генетики», путем трансфекции клеток Vero набором из 8 двунаправленных экспрессионных плазмид, содержащих кДНК копии генов вируса гриппа (Hoffmann et al., 2000). Вакцинный штамм VN1203delNS1 был сконструирован как 3:5 реассортант и содержал гены НА, NA и М, соответствующие потенциальному пандемическому штамму вируса гриппа A/Вьетнам/1203/04 (H5N1). Последовательности были получены из базы данных GenBank (код доступа AY818135 для гена НА, AY818141 для гена NA, и AY818144 для М). Оставшиеся 5 генетических сегментов, кодирующие белки РВ2, РВ1, РА, NP и NS происходили от вакцинного штамма IVR-116, рекомендованного ВОЗ для производства вакцин. В NS геномном сегменте открытая рамка считывания (ОРС) NS1 была удалена (Garcia-Sastre et al., 1998). Ранее было показано, что делеция белка NS1 определяет репликативно-дефектный фенотип всех вирусов гриппа А, независимо от их подтипа и вирулентности. Укороченный фрагмент NS служит четким генетическим маркером для вакцинных штаммов delNS1. Вирулентность высоко патогенных штаммов вируса гриппа А H5N1 обусловливается наличием кластера положительно заряженных аминокислот в сайте расщепления белка НА. Сайт расщепления высоко патогенных вирусов может нарезаться различными клеточными протеазами, особенно фуриновыми протеазами, которые присутствуют в большинстве клеток (Perdue et al.,1997). Поэтому вирусы дикого типа могут быстро распространяться и реплицироваться почти в любом органе, в свою очередь, вызывая системную инфекцию. Было обнаружено, что патогенность для цыплят находится в прямой зависимости от способности вирусов расщеплять НА в зараженных клетках в отсутствие экзогенного трипсина (Bosch et al.,1979). Для того, чтобы реассортантый вакцинный вирус VN1203delNS1 приобрел низко патогенный фенотип, сайт расщепления белка НА от штамма А/Вьетнам/1203/04(Н5N1) был модифицирован путем удаления участка положительно заряженных аминокислот по методике, описанной в работе Horimoto et al. (2006). Полиосновный сайт расщепления НА RERRRKKR/GLF, характерный для высокопатогенных вирусов гриппа птиц, во всех штаммах был заменен на трипсинозависимую последовательность TETR/GLF, типичную для непатогенных Н5 вирусов. Животные. Исследования проведены согласно "Пpавилам пpоведения pабот с иcпользованием экспеpиментальных животных" (приказ №266 МЗ РФ от 19.06.2003) в НИИ медицинской приматологии РАМН (г.Сочи). В работе использовали взрослых (4-6 лет) самцов яванских макак (Macaca fascicularis). Иммунизация. Яванских макак иммунизировали интраназально под наркозом (кетамин - 20 мг/кг и ксилазин - 1 мг/кг) двукратно с интервалом 4 недели. 12 животных были проиммунизированы вакцинным штаммом VN1203delNS1. Контрольная группа (n=6) животных получила соответсвующий объем фосфатного буферного раствора (ФБР). Определение вирусной нагрузки в образцах тканей и носовых смывов проводили методом титрования на клеточной культуре Vero. Определение ТИД50 проводили по методу Рида и Мюнча (1938). Реакцию микронейтрализации (МН) и РТГА (с использованием 1,0% взвеси эритроцитов лошади) проводили по методикам, описанным ранее (Romanova et al., 2009). ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Rotor-Gene 6000, Австралия) осуществляли c использованием набора АмплиСенс Influenza virus A/H5N1 ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Секвенирование. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генома вируса гриппа А/H5N1 проводили на приборе ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) с использованием набора «BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit». РЕЗУЛЬТАТЫ Безопасность. С целью оценки безопасности вакцинного штамма VN1203delNS1 в течение 10 дней после первой и повторной иммунизаций проводилось ежедневное наблюдение за развитием у макак клинических симптомов гриппозной инфекции (чихание, выделения из носа, снижения уровня активности), контроль неврологических проявлений и температуры тела. Массу тела животных измеряли ежедневно в течение первой недели после вакцинации и 1 раз в неделю при дальнейшем наблюдении. В результате вакцинации макак вакцинным кандидатом VN1203delNS1 в дозе 107.5 TИД50/животное ни у одного из вакцинированных животных не было выявлено развития клинических симптомов инфекции, каких-либо неврологических проявлений, снижения массы тела. За период наблюдения был зарегистрировано небольшое повышение средних показателей веса у отдельных животных. Изменения некоторых нормативных параметров биохимического и гематологического анализов образцов крови, полученных до иммунизации и через 4 недели после введения препарата, были незначительны, оставаясь в пределах нормальных значений. При сравнении показателей температуры тела до и после иммунизации значимых изменений не отмечено. Полученные данные свидетельствуют о безвредности применения препарата VN1203delNS1 у животных. После первой иммунизации оценивали способность вакцинного штамма распространятся от места аппликации вакцинного вируса VN1203delNS1 в другие органы и выделение его из респираторного тракта иммунизированных животных. Оценка вирусовыделения вакцинного штамма из респираторного тракта вакцинированных животных осуществлялась путем титрования назальных смывов на культуре клеток Vero методом определения ТИД50. Образцы носовых смывов были собраны у всех подопытных животных через 24, 48 и 72 после первой иммунизации. У 4 из 12 вакцинированных животных изоляция вакцинного вируса в следовых количествах (менее 1,5 lgТИД50 в мл смыва) была показана через 24 и 48 часов после иммунизации и только у одного животного вирус был изолирован в титре 2,0 lgТИД50/мл. Через 72 часа ни у одного из опытных животных вакцинный штамм не был изолирован в носовых смывах. Случаи изолирования вируса из носовых смывов яванских макак могли быть либо следствием выживания вакцинного вируса в инокулуме при высокой заражающей дозе (7.5 lg ТИД50 на животное), либо продуктом первого абортивного цикла репликации. Отсутствие или очень низкий уровень репликации вируса в организме животных объясняется усилением запуска врожденной иммунной системы delNS1 вирусами, сравнимыми с инфекцией, вызываемой вирусами дикого типа (Ferko et al., 2004). Быстрое распознавание инфекции delNS1 вирусами врожденной иммунной системой приводит к незамедлительному установлению противовирусного статуса в респираторных клетках в месте аппликации вакцины и, соответственно, блокированию вирусного распространения. Кроме этого, местная индукция цитокинов и хемокинов привлекает и активирует дендритные и антигенпрезентирующие клетки, которые являются ключевыми для подключения адаптивного иммунитета. Таким образом, delNS1 вакцины могут стимулировать адаптивный иммунный ответ без добавления адъюванта. Для всех изолированных из носовых смывов макак вирусных штаммов было проведено определение длины геномного сегмента NS методом ОТ-ПЦР и секвенирование фрагмента НА, включающего сайт расщепления. Скрининг всех вирусных изолятов показал, что все выделенные из носовых смывов макак штаммы имели укороченный NS фрагмент генома (418 п.о.), соответствующей удаленной NS1 ОРС вакцинного штамма. Секвенирование фрагмента гена НА (длина 297 п.о. (889-1186п.о.)) показало, что ни у одного из 5 вирусных изолятов нет замены в данном участке НА. Последовательности для всех изолятов были идентичные и соответствовали НА вакцинного штамма VN1203delNS1 и имели модифицированный сайт расщепления НА TET/RGLF. Таким образом, для всех изолированных вирусов была показана сохранность факторов аттенуации вакцинного кандидата VN1203delNS1. На 5 день после первой иммунизации у 2 животных, выбранных случайным образом, были собраны образцы тканей легких, носового эпителия, мозга и селезенки. Для того, чтобы определить вируса в тканях иммунизированных животных, из трех разных участков каждого органа было приготовлено 3 пробы, а затем для всех проб (12 для каждого животного) была выполнена ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса гриппа H5N1. Для обоих животных во всех пробах было показано отсутствие репликации вакцинного вируса, в ОТ-ПЦР вирусной РНК ни в одной пробе выявлено не было. Полученные данные свидетельствуют о том, что вакцинный вирус безопасен и не распространяется из места аппликации (слизистой носа) в отдаленные органы и ткани. Иммуногенность вакцинного кандидата VN1203delNS1 на модели яванских макак. Для изучения иммунного ответа у подопытных животных были получены сыворотки до иммунизации, через 30 дней после однократной и 21 день после двукратной иммунизаций. Развитие антительного иммунного ответа оценивали в РТГА и РМН, с использованием в качестве антигеном 6:2 реассортантные вирусы, относящиеся к различным клайдам субтипа H5N1. Реассортантный вирус А/Вьетнам/1203/04, относящийся к клайду 1, был использован в качестве гомологичного антигена, а вирусы А/Индонезия/5/05 и А/Курган/5/05, относящиеся к клайду 2, использовались как гетерологичные антигены (табл 1). Таблица 1 Индукция иммунного ответа по данным РТГА и РМН у яванских макак, иммунизированных вакцинным штаммом VN1203delNS1 Группа Вакцина ция Средние геометрические титры к антигенам после однократной/повторной вакцинации (разброс титров) А/Вьетнам/1203/04 А/Индонезия/5/05 А/Курган/5/05 РТГА МН РТГА МН РТГА МН VN1203delNS1 (n=10) Одно-кратная 36,8 (8-256) 194,5 (32-512) 10,2 (4-32) 18,4 (8-128) 19,7 (4-256) 64 (8-512) Контроль ФБР (n=6) Одно-кратная <4 <8 <8 <8 <8 <8 VN1203delNS1 (n=10) Дву-кратная 238,9 (64-1024) 955,4 (128-4096) 16,0 (4-128) 78,8 (32-512) 32 (4-512) 78,5 (32-1024) Контроль ФБР (n=6) Дву-кратная <4 <8 <8 <8 <8 <8 Однократная иммунизация яванских макак вакцинным штаммом VN1203delNS1 вызывала формирование сывороточного антительного ответа к гомологичному штамму H5N1 у 100% животных, что было показано как в РТГА, так и реакции микронейтрилизации. Сероконверсия к гетерологичным H5N1 штаммам клайда 2 после однократной иммунизации по данным РТГА была показана для 50% животных в случае А/Индонезия/5/05 и 50% в случае А/Курган/5/05, и по результатам РМН для 60% животных в случае А/Индонезия/5/05 и 70% в случае А/Курган/5/05. Повторная вакцинация приводила к увеличению сывороточных антител как к гомологичному штамму А/Вьетнам/1203/04, так и гетерологичным штаммам. Так, после повторной вакцинации 100% животных приобрели нейтрализующие (данные РМН) антитела к H5N1 вирусам клайда 2: к А/Индонезия/5/05 и к А/Курган/5/05. Длительность антительного сывороточного ответа была проверена у 5 вакцинированных животных, сыворотки которых были получены через 6 месяцев после первой вакцинации. Титр сывороточных антител в РТГА к гомологичному штамму А/Вьетнам/1203/04 сохранялся у всех животных (100%) и СГТ составлял 27,8. ВЫВОДЫ Полученные результаты показали возможность и оправданность использования яванских макак в качестве модельных животных для оценки безопасности и иммуногенности живых гриппозных вакцин, с удаленным NS1 сегментом генома. Проведенное на макаках исследование позволило сделать заключение о том, что вакцинный штамм VN1203delNS1 является безвредным и безопасным, не распространяется от места аппликации в отдаленные органы и ткани, а иммунизация (в дозе 107,5 ТИД50 на животное) не приводит к развитию каких-либо клинических симптомов, признаков заболевания и изменения гематологической или биохимической картины крови. По данным РТГА и МН уже однократная вакцинации была достаточна для формирования сывороточного антительного ответа у 100% животных. Повторная вакцинация приводила к значительному увеличению титров сывороточных антител. Результаты настоящих и полученных ранее (Wressnigg et al., 2009; Wacheck et al., 2010) доклинических исследований свойств вакцинных кандидатов с удаленным NS1 сегментом генома, продемонстрировали возможность и перспективность применения данного подхода при разработке нового поколения живых аттенуированных гриппозных вакцин. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Baskin C.R., Bielefeldt-Ohmann H., Garc?a-Sastre A. et al. Functional genomic and serological analysis of the protective immune response resulting from vaccination of macaques with an NS1-truncated influenza virus// J Virol. – 2007. – Vol.21. –P.11817-27. 2. Bosch, F. X., Orlich, M., Klenk, H. D. & Rott, R. The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza viruses// Virology. –1979. –Vol.95. –P. 197-207. 3. Egorov A., Brandt S., Sereinig S. et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells//J. Virol.–1998.–Vol.72.–P.6437-41. 4. Falc?n A.M., Fernandez-Sesma A., Nakaya Y. et al. Attenuation and immunogenicity in mice of temperature-sensitive influenza viruses expressing truncated NS1 proteins// J Gen Virol.–2005.–Vol.86.–P.2817-21. 5. Fan S., Gao Y., Shinya K. et al. Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated H5N1 vaccine in nonhuman primates// PLoS Pathog. –2009. – Vol.5.(5):e1000409. 6. Ferko B., Stasakova J., Romanova J. et al. Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes//J. Virol.–2004.–Vol.78.–P.13037-45. 7. Garcia-Sastre A., Egorov A., Matassov D. et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems//Virology.–1998.–Vol.252.–P.324-30. 8. Hoffmann E., Neumann G., Kawaoka Y. et al. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.–2000.–Vol.97.–P.6108-13. 9. Horimoto, T., Takada, A., Fujii et al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate//Vaccine.–2006. – Vol.24.–P. 3669-76. 10. Perdue, M. L., Garcia, M., Senne, D. & Fraire, M. Virulence-associated sequence duplication at the hemagglutinin cleavage site of avian influenza viruses// Virus Res. –1997. –Vol. 49. –P.173-86. 11. Richt J.A., Garc?a-Sastre A. Attenuated influenza virus vaccines with modified NS1 proteins// Curr Top Microbiol Immunol. –2009. –Vol.333. –P.177-95. 12. Rimmelzwaan G.F., Kuiken T., van Amerongen G. et al. Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model// J Virol. –2001. –Vol.75. –P. 6687-6691. 13. Romanova J., Krenn B.M., Wolschek M et al. Preclinical evaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1 H5N1 influenza vaccine// PLoS One.–2009.–Vol.4(6):e5984. 14. Talon, J., Horvath, C. M., Polley, R., Basler, C. F., Muster, T., Palese, P. & Garcia-Sastre, A. Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the influenza A virus NS1 protein // J Virol. - 2000. – V. 74. – P. 7989-7996. 15. van Riel, D., Munster, V. J., de Wit, E et al. H5N1 Virus Attachment to Lower Respiratory Tract// Science. –2006. –Vol.312. –P.399. 16. Wacheck V., Egorov A., Groiss F. et al. A novel type of influenza vaccine: safety and immunogenicity of replication-deficient influenza virus created by deletion of the interferon antagonist NS1//J. Infect. Dis.–2010.–Vol.201(3).–P.354-62. 17. Wressnigg N., Voss D., Wolff T. et al. Development of live-attenuated influenza В DeltaNS1 intranasal vaccine candidate//Vaccine.–2009.–Vol.27.–P.2851-7. SAFETY AND IMMUNOGENICITY OF H5N1 LIVE INFLUENZA VACCINE LACKING NS1 ORF IN MACACA FASCICULARIS Е.Romanovskaya-Romanko*, B. Ferko***, О. Vyshemirskii**, J.Romanova*,***, М. Grudinin*, B. Lapin**, А.Еgorov*,***, О. Кiselev* * Influenza Research Institute Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Saint-Petersburg, Russia; ** Research Institute of medical primatology RAMS, Sochi, Russia; *** AVIR GreenHillsBiotechnology AG, Wien, Austria. The increased circulation of highly pathogenic H5N1avian influenza viruses in birds with a periodic lethal infection of humans has lasted for more than ten years. A very high mortality rate (exceeding 50%) and the appearance of several distinct clades of H5N1 viruses intensify the necessity for an efficient cross-clade protective vaccine to prevent a possible pandemic among the na?ve human population. The use of recombinant influenza viruses with truncated or mutated NS1 proteins as promising live-attenuated virus vaccines has been demonstrated. Such viruses are partially debilitated in their ability to counteract the host IFN response, but are able to replicate to high titres in suitable IFN-deficient systems, such as Vero cells that is necessary for successful production . These vaccine candidates can be administered intranasally, demonstrate replication-deficient phenotype in immunocompetent host and deletion of the entire NS1 gene guarantees the genetic stability of this replication-deficient phenotype. Although mouse models have provided insight into the pathogenesis of influenza A (H5N1) viruses in a mammalian host, this cannot be extrapolated to humans directly. Earlier it was demonstrated that such animals as Macaca mulatta и Macaca fascicularis are acceptable for assessment of H5N1 influenza virus pathgenesis (Rimmelzwaan et al.,2001), since the clinical signs in the cynomolgus macaques resembled those found in humans infected with the avian influenza H5N1 viruses (Fan et al.,2009). In this study we used M. fascucularis as a model for evaluation of safety and immunogenicity of influenza live attenuated H5N1 vaccine strain with deleted NS1 ORF. Influenza vaccine virus VN1203delNS1 was rescued as 3:5 reassortant entirely from cDNA clones by co-transfection of a set of 8 plasmids into Vero cells. Plasmids encoding the HA (with modified cleavage site), NA and M genes were derived from the sequences of the influenza A/Vietnam/1203/04 (H5N1) strain recommended by the WHO as the potential pandemic strain. The remaining 5 gene segments PB2, PB1, PA, NP and NS (NS segment lacks the NS1 gene open reading frame) originate from the IVR-116 vaccine strain distributed by the WHO for vaccine production. 4-6 aged males M. fascucularis were immunized twice under narcosis with VN1203delNS1 in dose 107,5 lgTCID50 per animal. Safety and immunogenicity were evaluated after single and double immunization. In safety vaccine candidates assessment it was shown that H5N1 vaccine candidate VN1203delNS1 was safe, did not induce a febrile response or respiratory and/or neurological symptoms in macaques and did not spread from place of application (nasal mucosa) to distinct tissues and organs. Vaccine strain shedding analysis shown that low virus recovery (<1,5 lgTCID50/ml) was observed in vaccinated animals only on day 2 (24 hours) and day 3 (48 hours), but no virus recovery on day 4 following immunization. Single immunization of M. fascucularis with VN1203delNS1 provided ?4-fold increase of HAI (GMT=36,8 ) and MNA (GMT=194,5) antibody titres to homologous antigen A/Vietnam/1203/04 (clade 1) in 100% of animals and significantly increase of titres following double immunization. After double immunization 100% animals obtained ?4-fold increase of neutralizing antibody titres to antigen of heterologous H5N1 viruses clade 2. It was clearly shown that VN1203delNS1was able to induce a long lasting immune response in M. fascicularis as even after 6 months post immunisation all animals demonstrated detactable HAI titres to homologous clade 1 antigen (GMT 27,8). This and previous preclinical studies (Wressnigg et al., 2009; Wacheck et al., 2010) demonstrated possibility and availability of approach based on deletion NS1 ORF for development new generation of live vaccine. Safety and immunogenicity were demonstrated in primate model. For pandemic preparedness purposes, VN1203delNS1 vaccine can thus be considered an alternative to conventional, inactivated influenza vaccines. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИМАТОВ ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ КОМПЛЕКСНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА. Новикова Л.И.*, Алешкин В.А*, Зуева М.М.*, Волков А.В.*, Борисова И.В.*, Аршба И.М. **, Вышемирский О.И.**, Джикидзе Э.К. **, Чугуева И.И. ** *ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, Москва, Россия **НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Введение. Комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП), разработанный в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и внедренный в практику здравоохранения с 1991 г. в виде перорального лекарственного средства, предназначен для профилактики и терапии кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии. При таком местном применении на слизистой желудочно-кишечного тракта антитела одной специфичности, но различных изотипов, содержащиеся в КИП, способны к агглютинации и преципитации энтеропатогенных инфекционных агентов, обеспечивая нейтрализацию патогенетических механизмов инфекции. За 20-летний период клинического применения КИП зарекомендовал себя как надежное противоинфекционное средство, эффективное не только как элемент комплексной терапии, но и как самостоятельный препарат. В то же время благодаря широкому спектру антител в КИП и тому обстоятельству, что этот иммунобиологический препарат содержит антитела, принадлежащие к трем основным классам иммуноглобулинов – G, A и M, весьма перспективными представляются исследования, направленные на расширение сферы местного применения КИП и создание лекарственной формы, предназначенной для действия на других слизистых оболочках, например, на слизистой респираторного тракта. В настоящее время в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского на стадии разработки находится препарат "КИП назальный". Интраназальная форма будет предназначена для профилактики и терапии инфекций верхних дыхательных путей различной этиологии. Показано, что среди антител многих специфичностей в КИП находятся также и антитела к респираторным патогенам, в первую очередь, вирусной природы. Имеются IgG- и IgА-антитела к вирусам гриппа (А+В) и респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ), IgG-антитела к вирусу парагриппа 2, а также антитела разных изотипов к ряду бактерий, которые могут обсеменять носоглотку (например, золотистому стафилококку). Известно, что при местном применении иммуноглобулинов на слизистой респираторного тракта наряду с нейтрализующим бактерии и вирусы действием антител всех изотипов на поверхности слизистой полимерные иммуноглобулины (IgA, IgM) могут попасть из просвета дыхательных путей внутрь эпителиальных клеток благодаря трансэпителиальному транспорту и способствовать нейтрализации вирусов внутри зараженных клеток. Получена экспериментальная серия препарата «КИП назальный» (серия №1), представляющая собой раствор во флаконах (по 5 мл), предназначенный для закапывания в нос. Препарат проконтролирован на стерильность, токсичность (мышиная модель), содержание иммуноглобулинов трех классов (G, A и M) и вирусную безопасность согласно ФСП 42-0194695405 на «Иммуноглобулиновый комплексный препарат (КИП)». В препарате были определены рН, концентрация белка биуретовым методом, а также он был проанализирован методом ИФА на содержание специфических антител IgG-, IgA-, IgM-классов к ряду респираторных патогенов вирусной и бактериальной природы. Характеристики препарата представлены в таблице 1. Таблица 1 . Характеристика препарата «КИП назальный» (серия №1). Наименование параметра Значение параметра Описание Прозрачная слегка опалесцирующая жидкость голубого цвета Белок 35,6 мг/мл рН 7,09 Соотношение основных классов иммуноглобулинов IgG – 70,5%, IgA – 10%, IgM – 19,5% IgG-специфическая активность против вирусов гриппа А+В 113 ОЕд/мл против РСВ 152 ОЕд/мл против S.aureus 1:10240 IgА-специфическая активность против вирусов гриппа А+В R=1,34 против РСВ R=1,13 против S.aureus 1:2560 IgM-специфическая активность против S.aureus 1:160 Стерильность Стерилен Токсичность Не токсичен Вирусная безопасность HBsAg Отсутствует Антитела к вирусу гепатита С Отсутствуют Антитела к ВИЧ 1+2 Отсутствуют Цель исследований. Проведение доклинических испытаний экспериментальной серии препарата «КИП назальный» на приматах. Материалы и методы. Испытания по изучению безвредности (переносимости) препарата «КИП назальный» проводились на базе НИИ медицинской приматологии РАМН (г.Сочи-Адлер). В опытах было задействовано 12 здоровых макаков резусов в возрасте от 2,5 до 3,5 лет (все самцы). Восемь животных (опытная группа) получали КИП капельно по 300 мкл (150 мкл в каждый носовой ход) 2 раза в день, т.е. суммарная суточная доза препарата на каждую обезьяну составила 600 мкл. Препарат вводился 5 дней подряд. Четыре контрольные обезьяны (контрольная группа) вместо КИП получали в течение 5 дней интраназально равные объемы стерильного физиологического раствора. Кратность введения КИП уменьшили с 3-х раз в день до 2-х с целью снижения стрессовой нагрузки, вызванной иммобилизацией животного. КИП вводили без наркоза. В течение 5-и дней проводили наблюдение за поведением животных, отмечали наличие катаральных или диспептических явлений, симптомов интоксикации. В первый день опыта обезьян наркотизировали, делали ректальное измерение температуры, взвешивали, производили забор крови из паховой вены. Второй раз животных наркотизировали на 7-ой день от начала опыта и повторяли процедуры, как и при первом введении наркоза. В остальные дни наблюдения (2-,3- и 4-й дни опыта) измерение температуры и веса тела не производили, т.к. не вводили наркоз в целях уменьшения стрессового воздействия на животных. Кровь использовали для выполнения клинического анализа и получения сыворотки. В образцах сыворотки крови методом радиальной иммунодиффузии по Манчини определяли концентрацию основных классов иммуноглобулинов (G, A, M). Бактериологические исследования материала из носовых ходов опытных и контрольных обезьян производили до введения препарата «КИП назальный» и спустя 19 дней после окончания курса. Материал из носовой полости забирали сухим стерильным ватным тампоном, который вводили вглубь носа, предварительно очистив поверхность носа обезьян стерильной ватой, смоченной физиологическим раствором. Для бактериологического исследования были использованы следующие дифференциально-диагностические среды: 5%-ный кровяной агар, желточно-солевой агар, мясопептонный агар, среда Эндо и среда Сабуро (для выделения грибов). Посевы исследуемого материала просматривали после 18-24- и 48-часовой инкубации при (+370C). Учитывали количество выросших колоний, соотношение отдельных ассоциантов, описывали характер колоний, гемолитические и лецитиназно-активные свойства. Отмечали их морфологические и тинкториальные свойства (кокки, палочки, отношение к окраске по Граму). Рост микроорганизмов на питательных средах оценивали по 4-х- бальной системе от единичных колоний до обильного роста колоний по всей поверхности исследуемых чашек. Результаты исследований. Наблюдение за испытуемыми обезьянами в течение 5 дней при ежедневном интраназальном введении КИП не выявило каких-либо негативных изменений в поведении животных в сравнении с контролем. Лишь один самец опытной группы проявлял признаки возбудимости на 1-, 2- и 4-й дни наблюдения, что, вероятнее всего, связано не с введением препарата, т.к. происходило не каждый день, а с взаимоотношением этой особи с окружающими обезьянами. Не наблюдалось существенных изменений массы и температуры тела у обезьян обеих групп. Интраназальное введение препарата не сопровождалось появлением симптомов интоксикации, а также катаральных и диспептических явлений. Применение препарата «КИП назальный» в течение 5 дней не вызвало никаких характерных изменений в составе крови подопытных животных. Содержание лейкоцитов и лимфоцитов, а также лейкограмма крови, зарегистрированные до и после введения КИП, укладываются в нормальные диапазоны этих показателей, известные из литературы. Лишь у одного самца из опытной группы по окончании срока наблюдения зафиксирована эозинофилия, что, вероятнее всего, связано с глистной инвазией. Интраназальное введение КИП не вызвало существенных изменений количества эритроцитов, гемоглобина и СОЭ. Показатели красной крови у всех использованных для эксперимента подопытных животных, независимо от группы, находились на нижней границе нормы или были несколько ниже нормы. Почти у всех обезьян наблюдалась гипохромная анемия алиментарного генеза. Это связано с тем, что все самцы, используемые в испытаниях, являлись низкоранговыми животными с плохим доступом к корму в вольерах. В целом, результаты общего анализа крови свидетельствуют о чрезвычайной лабильности некоторых показателей у обезьян обеих групп, что согласуется с данными литературы. Известно, что на фоне стресса, который вызывают любые манипуляции с животными (в данном случае фиксация обезьян и введение препаратов), у макак резус регистрируется высокий разброс показателей лейкоцитов и лимфоцитов – от 4 до 87 %. В наших испытаниях животные обеих групп оказались очень чувствительными даже к разовому забору крови. Концентрация основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови подопытных животных в процессе испытаний не претерпела существенных изменений. В целом, содержание IgG, IgA и IgМ в крови находилось в пределах 15-50 мг/мл, 4-10 мг/мл и 0,5-1,7 мг/мл, соответственно. В отделяемом из носовой полости обезьян в норме обнаруживаются следующие грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы: Staphylococcus epidermidis, Streptococcus viridans, некоторые представители родов Neisseria, Corynebacterium, Lactobacillus и др., а также грибы рода Candida. Результаты бактериологического анализа состава микрофлоры носа по общей схеме дифференцировки у 12 подопытных животных представлены в таблице 2. Смешанный характер роста с грамотрицательными бактериями, в частности, кишечной палочкой (E.coli), в количестве 1-8 колоний был отмечен у каждой обезьяны, что свидетельствует о банальной загрязненности полости носа у такого рода животных. Чаще выделялись грамположительные кокки Staphylococcus spp. (в двух случаях – Staphylococcus aureus), грамположительные микрококки, диплококки, сарцины, грамотрицательные кокки Neisseria spp., неферментирующие грамотрицательные палочки, грамположительные палочки. Грибы рода Таблица 2. Бактериологический анализ микрофлоры носовой полости обезьян до и после интраназального введения КИП № Номер животного До введения КИП После введения КИП 1 37656 контроль Стафилококки, нейссерии, грамотрицательные палочки Нейссерии, грамотрицательные палочки 2 37787 контроль Диплококки, нейссерии, грамположительные палочки Диплококки, грамположительные палочки 3 37752 контроль Стафилококки, грамотрицательные кокки, грамотрицательные палочки Грамотрицательные и грамположительные кокки, грамотрицательные палочки 4 37642 контроль Диплококки, грамотрицательные палочки Диплококки, грамотрицательные кокки, грамотрицательные палочки 5 37718 Сарцины, грамотрицательные палочки, Диплококки, грамотрицательные палочки 6 37657 Сарцины, диплококки, грамотрицательные палочки Сарцины, диплококки 7 37219 Стафилококки, S. aureus, грамотрицательные и грамположительные палочки Стафилококки, грамотрицательные кокки. 8 37034 Диплококки, грамотрицательные палочки Диплококки, нейссерии 9 37112 Стафилококки, нейссерии, грамотрицательные палочки Стафилококки, диплококки 10 37138 Диплококки, нейссерии Диплококки, грамположительные палочки 11 37636 Стафилококки, S. aureus, грамотрицательные палочки Стафилококки, грамотрицательные палочки 12 37685 Нейссерии, грамотрицательные палочки Грамотрицательные палочки, грамположительные палочки Candida обнаружены не были. В испытаниях участвовали здоровые животные, поэтому каких-либо характерных изменений количественного и качественного состава микрофлоры носа во время использования препарата выявлено не было. Тем не менее, необходимо отметить, что у двух опытных макаков (№№ 37219 и 37636) до введения КИП обнаруживался S.aureus, тогда как после курса терапии он из мазков слизистой носа не выделялся. Подобное наблюдение можно связать с наличием в препарате специфических антител IgG-, IgA- и IgM-изотипов к комплексному антигену стафилококка. Выводы. На здоровых обезьянах – макаках резус – проведены испытания интраназальной формы комплексного иммуноглобулинового препарата (препарат «КИП назальный» в виде капель в нос) на безвредность (переносимость). Испытания продемонстрировали хорошую переносимость препарата «КИП назальный». Не было отмечено негативного влияния на поведение и общее состояние животных. Не зафиксировано повышение температуры, изменение массы тела, наличие каких-либо катаральных, диспептических явлений или симптомов интоксикации. Препарат не оказывал существенного влияния на показатели общего анализа крови. Во время испытаний не выявлено каких-либо характерных изменений количественного и качественного состава микрофлоры носа обезьян. Тем не менее, бактериологический анализ показал возможность санации носовой полости от представителей патогенной микрофлоры при использовании интраназальной лекарственной формы КИП. В заключение необходимо отметить, что приматы являются удобной моделью для испытаний иммунобиологических препаратов человеческого происхождения. НОВЫЙ ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ПРЕПАРАТ - ТРИАЗАВИРИН. ОТ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ К КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ. Э.Г. Деева*, Т.И. Мельникова*, Т.Г. Лобова*, В.Л. Русинов**, О.И.Киселев* * - ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ, г. Санкт-Петербург ** - ИОС УрО РАН, г. Екатеринбург Одним из актуальных направлений современной медицинской науки является разработка противовирусных препаратов широкого спектра действия. Это продиктовано полиэтиологичностью и контагиозностью вирусных инфекций, высокой изменчивостью вирусов и появлением новых особо опасных агентов. Первая волна пандемии гриппа А/H1N1/2009 обозначила ряд серьезных проблем – отсутствие выбора средств противовирусной терапии, инъекционных препаратов для лечения тяжелых форм заболевания, ограничение использования препаратов вследствие появления резистентных штаммов. Перечисленные проблемы противовирусной терапии диктуют необходимость разработки и практического внедрения новых эффективных средств профилактики и лечения вирусных заболеваний. Скрининг, проведенный среди соединений азоло-азинов, структурных аналогов пуринов, позволил выявить ряд наиболее перспективных соединений с высокой противовирусной активностью, в ряду которых особое место занимает Триазавирин (1). В настоящее время препарат Триазавирин прошел все стадии доклинического изучения и I- II фазы клинического исследования. Изучение специфической активности препарата Триазавирин показало, что он обладает высокой противовирусной активностью при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей (индекс эффективности - 65-75%), обеспечивает высокую степень защиты инфицированных мышей и значительно увеличивает продолжительность их жизни (2, 3). В экспериментах со штаммом вируса гриппа A/California/7/09 (H1N1)v, было установлено, что индекс эффективности Триазавирина составляет от 40 до 60%, при этом существенно увеличивается продолжительность жизни животных. Рис. 1. Снижение инфекционной активности вируса гриппа A/California/7/09 (H1N1)v в легких при экспериментальной гриппозной инфекции на мышах в условиях применения Триазавирина. Применение препарата Триазавирин снижало репликацию вируса в легких на 1-3 порядка в зависимости от использованной дозы вируса (рис.1). Проведенные экспериментальные исследования общей токсичности показали, что препарат Триазавирин малотоксичен (рис. 2). Величины ЛД50 при внутрижелудочном введении у мышей и крыс составляют 8000-9500 мг/кг. Рис.2. Токсикологические характеристики препаратов Триазавирина и ремантадина. Хроническое введение препарата Триазавирин экспериментальным животным в дозах в 6-12 раз превышающих рекомендуемые для клинического изучения не оказывает вредного воздействия на основные системы организма. Изучение фармакокинетического профиля препарата проводили на 3-х видах лабораторных животных – крысы, кролики, макаки-резус (рисунок 3). Рис. 3. Концентрация препарата Триазавирин в плазме крови макаков-резус. В целом фармакокинетика Триазавирина характеризуется быстрым достижением максимальных концентраций (через 50 минут после введения капсулы), отсутствием выраженных пиков и стабильностью концентраций на всем интервале наблюдения. Длительное выведение препарата из организма и отсутствие значимой кумуляции благоприятно с точки зрения возможности многократного использования препарата. Таким образом, изучение фармакокинетики препарата Триазавирин, проведенное на животных, в том числе на макаках-резус, позволило определить режим применения для клинических испытаний у человека. Целью исследования первой фазы клинического исследования по протоколу «Оценка безопасности, переносимости и фармакокинетики препарата Триазавирин на здоровых добровольцах» было изучение безопасности и переносимости препарата, а также оценка фармакокинетических параметров. В ходе проведенного исследования установлена безопасность и хорошая переносимость препарата Триазавирин. Все группы пациентов, получавших Триазавирин в нарастающих дозировках (максимальная разовая доза – 1000 мг, максимальная суточная доза 1 500 мг, максимальная курсовая доза – 10 500 мг) завершили исследование без неблагоприятных реакций, связанных с приемом препарата. Колебания величин лабораторных показателей не выходили за пределы физиологических норм ни в одной из 9 испытанных схем применения препарата. Изучение фармакокинетики препарата показало, что после приема внутрь Триазавирин быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте. Максимальные концентрации достигаются в среднем через 1-1,5 ч и возрастают пропорционально принятой дозе. Период полувыведения в среднем составляет 1,0-1,5 часа. Фармакокинетика Триазавирина носит нелинейный двухфазный характер. Анализ различных режимов приема Триазавирина свидетельствует, что только величина дозы влияет на максимально достижимые концентрации препарата в плазме крови, в то время как более длительному удержанию концентрации способствует регулярный прием и большая кратность дозирования (рис.4). Рис. 4. Фармакокинетические кривые Триазавирина в режимах многократного длительного приема в дозе 250 мг и 750 мг (клинические исследования). При анализе фармакокинетических параметров, полученных при различных схемах приема препарата Триазавирин, было показано, что Триазавирин обладал незначительной способностью к кумуляции при многократном приеме. В 2011 году на базе Института гриппа завершены клинические исследования II фазы по протоколу «Проспективное простое слепое плацебоконтролируемое клиническое исследование по изучению эффективности и безопасности препарата Триазавирин, капсулы 250 мг у пациентов с диагнозом грипп». Проведенные исследования показали высокую терапевтическую эффективность препарата (рис. 5). Рис.5. Основные показатели эффективности терапии гриппа при использовании препарата Триазавирин. Анализ динамики клинических показателей в исследуемых группах показал, что применение Триазавирина при лечении гриппа способствовало более быстрой ликвидации основных симптомов заболевания. Доказана лечебная эффективность Триазавирина при гриппе. Анализируя в целом соединения ряда азолоазинов, к которым принадлежит Триазавирин, можно с уверенностью утверждать, что это первый противовирусный препарат данного класса, который в будущем должен стать родоначальником целой группы соединений, обладающих широким спектром противовирусной активности. Литература 1. Деева Э.Г. «Изучение противовирусной активности соединений ряда азолоазинов, акридонов и флуоренов», автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук, 2000. 2. Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П., Котовская С.К., Русинов В.Л., Чарушин В.Н. Изучение противовирусной активности триазавирина в отношении возбудителя гриппа А(H5N1) в культуре клеток. Антибиотики и химиотерапия. 2007. № 52. С.18-20. 3. Karpenko I., Deev S., Kiselev O., Charushin V., Rusinov V., Ulomskiy E., Deeva E., et al. Antiviral properties, Metabolism, and Pharmacokinetics of a novel Azolo 1,2,4,-Triazine derived inhibitor of influenza A and B virus replication. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2010. V. 54. № 5. Р. 2017-2022. NEW ANTIVIRAL DRUG – TRIAZAVIRIN. FROM PRECLINICAL STUDIES TO CLINICAL PRACTICE E.Deyeva, T.Melnikova, T.Lobova, V.Rusinov, O.Kiselev. Antiviral drug Triazavirin, classified as part of the azolo-azine class compounds, has passed all of the stages of pre-clinical as well as phase I-II of clinical trials. Pre-clinical studies of specific activity and toxicological characteristics of Triazavirin showed that this drug possesses high antiviral activity in relation to influenza viruses types A and B, including A(H1N1)v, meanwhile maintaining low toxicity levels. The pharmacokinetic of Triazavirin, through research conducted on Rhesus macaque, characterized by a rapid onset of maximum concentrations of the drug in the blood, its stability and absence of significant accumulation. High therapeutic efficacy of the drug was proven in treatment of patients diagnosed with influenza. Treatment with this drug shortens the duration of common influenza symptoms, decreases incidence of complications and the level of secondary viral isolation. Safety and well tolerability of Triazavirin has been established. «ФИЗИОЛОГИЯ, КОСМИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА, РАДИОЛОГИЯ И ЭНДОКРИНОЛОГИЯ» СТАРЕНИЕ ГИПОТАЛАМО-ГИПОФИЗАРНО-АДРЕНАЛОВОЙ СИСТЕМЫ У НИЗШИХ ПРИМАТОВ С ДЕПРЕССИВНОПОДОБНЫМ И АГРЕССИВНЫМ ПОВЕДЕНИЕМ Гончарова Н.Д., Маренин В.Ю., Венгерин А.А., Оганян Т.Э, Лапин Б.А. Научно-исследовательский институт медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Частота заболеваний, в этиологии которых важная роль отводится стрессу, таких как депрессии и тревожные состояния, ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, цереброваскулярная недостаточность и некоторые другие, резко увеличивается в процессе старения [1,2]. С одной стороны, это может быть обусловлено повышенной стрессогенностью этого периода жизни в связи с потерей физического здоровья и социального положения, и т.п. С другой стороны, ряд внутренних факторов, обусловливающих понижение адаптационных способностей стареющего организма, прежде всего расстройства в функционировании гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС), могут быть ответственны, по крайней мере, частично, за ухудшение здоровья в старом возрасте [3,4]. Более того, вследствие гетерогенности процесса старения выявляются индивидуальные особенности в уязвимости и устойчивости организма к стрессу и стресс-зависимой патологии. Поэтому существенный интерес представляет изучение индивидуальных особенностей старения ГГАС и их связь со скоростью старения целостного организма и развитием стресс-зависимой патологии. Одним из перспективных подходов к изучению индивидуальных особенностей старения ГГАС является исследование характера функционирования этой системы в базальных условиях и в условиях стресса у индивидов с различным типом адаптивного поведения. Основанием для такого подхода являются литературные данные, свидетельствующие о наличии взаимосвязей между особенностями функционирования ГГАС и поведением индивидов [4-6]. Так, гиперактивация ГГАС отмечалась у лиц с повышенной тревожностью, при некоторых формах депрессии [6,7], а также у животных с депрессивноподобным поведением [5,8]. Однако, отсутствуют сведения об индивидуальной специфичности возрастных изменений ГГАС, в частности, данные о том, как функционирование ГГАС изменяется при старении у индивидов с различным типом адаптивного поведения. Вследствие сходства физиологии лабораторных приматов с человеком, использование низших обезьян для такого род исследований предпочтительнее, нежели грызунов. В частности, обезьяны сходны с человеком по основным параметрам суточного ритма активности ГГАС и представляют собой уникальную животную модель, для которых характерна надпочечниковая секреция DHEAS, претерпевающая, как и у человека, неуклонное снижение в процессе старения [9,10]. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей функционирования ГГАС у молодых и старых индивидов с разным типом адаптивного поведения в базальных условиях и в условиях острого психоэмоционального стресса на модели лабораторных приматов. Материал и методы Животные. В опытах было использовано 34 молодых взрослых (6-8 лет) и 34 старых (20–27 лет) здоровых самок макак резус (Macaca mulatta), содержащихся в питомнике НИИ медицинской приматологии. Животные обычно содержались в вольерах или клетках, предназначенных для группового содержания, а на время эксперимента были отсажены в индивидуальные метаболические клетки в изолированные комнаты с естественными температурой (20-28°С) и освещением (приблизительно с 06.00 до 18.00). Все эксперименты были выполнены в летнее время (июнь – август), когда для самок макак резусов не характерны овариальные циклы. Животные получали сбалансированное питание в виде брикетированного корма, изготавливаемого по технологии фирмы “Altromin” (Lage, Германия), а также свежих фруктов, овощей и вареного яйца. Вода была доступна в неограниченном количестве. В течение 4-х недель животные проходили курс адаптации к условиям пребывания в метаболических клетках и процедуре взятия образцов крови. Поведение животных оценивалось во время их пребывания в метаболических клетках, как в адаптационный период, так и собственно экспериментальный период. Оценка поведения проводилась с учётом ранее опубликованных рекомендаций для лабораторных приматов [11,12]. В зависимости от особенностей поведения молодые и старые животные были разделены на три группы. В первые группы вошли животные с активным агрессивным поведением (8 молодых половозрелых, 6.5 ± 0.3 лет, 5.7 ± 0.6 кг; 8 старых, 22.0 ± 0.4 лет, 5.7 ± 0.3 кг); вторые группы составили животные преимущественно с пассивным, депрессивноподобным поведением (13 молодых половозрелых, 6.9 ± 0.2 лет, 5.0 ± 0.2 кг; 13 старых, 22.2 ± 0.4 лет, 5.1 ± 0.2 кг); третьи группы включали животных с активным поведением и отсутствием четко выраженных свойств агрессивного или депрессивноподобного поведения, так называемым средним, или стандартным поведением (13 молодых половозрелых, 6.9 ± 0.2 лет, 5.3 ± 0.2 кг; 13 старых, 22.5 ± 0.4 лет, 5.7 ± 0.2 кг). Функция ГГАС оценивалась по концентрациям кортизола (F) и дегидроэпиандростерона сульфата (DHEAS) в плазме периферической крови в базальных условиях c учетом циркадианного ритма их секреции (в 9.00 и 21.00), а также в условиях умеренного острого психоэмоционального стресса (ограничения подвижности, нежесткой иммобилизации). Ограничение подвижности достигалось путем перемещения задней подвижной стенки клетки по направлению к передней и прижатию животного к передней стенке. Тело и конечности животного при этом не были жестко фиксированы. Животные подвергались стрессовому воздействию в 15.00. Взятие образцов крови проводили до начала иммобилизации (0), а также через 30, 60, 120, 240 мин и 24 часа после начала иммобилизации. Концентрацию F и DHEAS измеряли иммуноферментными методами с использованием стандартных коммерческих наборов (AлкорБио, Россия для F и DSL, США для DHEAS). Коэффициент вариации для концентрации F и DHEAS в пределах одной реакции не превышал 10%, в пределах разных реакций - 15%. Для оценки циркадианного ритма концентрации F рассчитывали амплитуду циркадианного ритма F – разность между содержанием F в 9.00 и 21.00. Все возрастные и межгрупповые различия анализировались с помощью метода Стьюдента и одно- и двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Результаты и обсуждение Активность ГГАС у молодых и старых самок макак резус с разным типом поведения в базальных условиях Результаты исследования уровня F в плазме крови у молодых и старых самок макак резус с разным типом адаптивного поведения не выявили статистически значимых ни межгрупповых, ни возрастных различий в 09.00. В тоже время уровни DHEAS у молодых агрессивных животных были выше по сравнению с животными со средним и депрессивноподобным типами поведения. У старых животных не было выявлено никаких статистически значимых межгрупповых различий. При этом концентрация DHEAS у старых животных всех поведенческих групп, включая животных с агрессивным поведением, была существенно ниже по сравнению с концентрацией DHEAS у молодых животных соответствующих групп. Наибольшим возрастным изменениям подвергалась концентрация DHEAS в 1-й группе животных (в 5,07 раз), а наименьшим – в 3-й (в 1,95 раз). У старых животных с депрессивноподобным поведением концентрация DHEAS снижалась в среднем в 2,56 раз. Наши данные о более высокой концентрации DHEAS у молодых животных с агрессивным поведением хорошо согласуются с результатами клинических исследований, отмечавших увеличение уровней DHEAS в плазме крови у лиц с агрессивным поведением [13]. Мы полагаем, что возросшие уровни DHEAS в циркуляции у приматов могут быть трансформированы в активные андрогены в различных периферических тканях, включая головной мозг [14] и/или ингибировать GABAA-рецепторы [8,15], что в любом случае может быть причиной агрессивного поведения. Так, хорошо известно, что тестостерон опосредует агрессивное поведение у различных видов животных и у человека [14]. С другой стороны, ингибирование GABAA-рецепторов усиливает агрессивное поведение [14,16]. Изучение величины соотношений между молярными концентрациями F и DHEAS в периферической крови у молодых самок макак резус в базальных условиях (в 09.00) позволило выявить минимальные значения этого соотношения у молодых животных с агрессивным поведением. При старении коэффициент F/DHEAS резко увеличивался у животных всех поведенческих групп. Однако самые высокие значения этого соотношения были отмечены у старых обезьян с депрессивноподобным поведением. Резкое возрастание коэффициента F/DHEAS в процессе старения отмечалось у различных видов лабораторных приматов [9,10], а также у человека [17,18]. В связи с антиглюкокортикоидными свойствами ДГАС, этот коэффициент рассматривается в качестве лучшего показателя гиперкортизолеми, чем измерение только F, и одного из важнейших биомаркеров старения. При старении амплитуда циркадианного ритма F значимо снижалась у животных с депрессивноподобным поведением, главным образом вследствие увеличения концентрации F в 21.00 и практически не претерпевала изменений у обезьян с агрессивным и средним поведением. Возрастные изменения в амплитуде циркадианного ритма F у животных с депрессивноподобным поведением приводили к межгрупповым различиям в амплитуде этого гормона у старых животных с минимальными значениями у самок с депрессивноподобным поведением. Снижение амплитуды циркадианного ритма F неоднократно отмечалось у человека и лабораторных приматов, и это обстоятельство позволило многим исследователям рассматривать данный параметр в качестве одного из биомаркеров старения [19,20]. Однако наше исследование, проведенное с учетом адаптивного поведения животных, продемонстрировало корректность использования данного параметра в качестве биомаркера старения только у обезьян с депрессивноподобным поведением. Высокие концентрации F в вечернее время отмечались и у больных с депрессией [21]. Активность ГГАС у молодых и старых самок макак резус с различным типом поведения в условиях острого умеренного психоэмоционального стресса Исследование характера изменений активности ГГАС у молодых и старых самок макак резус с различным типом адаптивного поведения в условиях острого психоэмоционального стресса позволило выявить в целом сходный характер у всех животных, независимо от возраста или поведения. Тем не менее, у старых животных с агрессивным и средним типом поведения концентрация F через 24 часа после начала иммобилизации была значимо ниже по сравнению с соответствующими значениями у молодых животных. Кроме того, она проявляла тенденцию к понижению у агрессивных животных через 30, 60, 120 и 240 мин, а у животных со средним типом поведения – через 120 мин после инициации стресса. У обезьян с депрессивноподобным поведением динамика уровней F в ответ на острое стрессовое воздействие не демонстрировала значимых возрастных различий или выраженной тенденции к возрастным различиям. При сравнительном изучении возрастных изменений динамики F в ответ на острое стрессовое воздействие в процентах от исходного уровня было установлено, что старые животные с агрессивным поведением демонстрируют статистически значимо более низкое увеличение концентрации F в ответ на иммобилизацию через 120, 240 мин и 24 часа после инициации стресса; а старые животные со средним типом поведения демонстрировали существенно более низкие концентрации F через 60, 120, 240 мин и 24 часа после начала воздействия. В тоже время не было выявлено статистически значимых возрастных различий в динамике F у животных с депрессивноподобным поведением. Выявленные возрастные изменения в стресс реактивности ГГАС у обезьян с агрессивным и средним типом поведения хорошо согласуются с результатами наших предыдущих работ, в которых было выявлено снижение стресс реактивности ГГАС у старых самок макак резус по сравнению с молодыми животными в послеполуденное время [3,22]. При этом специфические особенности адаптивного поведения животных не принимались в расчет. У старых животных с депрессивноподобным поведением выявлялась лишь слабая тенденция к снижению стресс реактивности ГГАС по сравнению с молодыми животного такого же поведенческого типа. Выявленное отсутствие значимых возрастных изменений в стресс реактивности ГГАС у обезьян с депрессивноподобным поведение вряд ли может указывать на их повышенную устойчивость к стрессовому воздействию или процессу старения. Напротив, ряд других гормональных биомаркеров (концентрация DHEAS, коэффициент F/DHEAS и амплитуда циркадианного ритма F) указывают на более выраженные возрастные изменения в активности ГГАС у обезьян с депрессивноподобным поведением. Более вероятно полагать, что отсутствие возрастных изменений в стресс реактивности F у животных с таким типом поведения приводит к более выраженной гиперкортизолемии при старении у животных с депрессивноподобным поведением. Таким образом, выявлено, что самки макак резус с различным типом адаптивного поведения демонстрируют сходные возрастные изменения в активности ГГАС, сопровождающиеся абсолютной и/или относительной гиперкортизолемией. При этом выраженность характера возрастных нарушений в активности ГГАС зависит от адаптивного поведения животных. Впервые обнаружено, что у обезьян с депрессивноподобным поведением возрастные нарушения функции ГГАС сопровождаются максимальной абсолютной и относительной гиперкортизолемией в базальных условиях, а также более высоким подъемом уровней F в плазме крови в условиях острого стресса. У молодых животных с агрессивным поведением выше уровни DHEAS и ниже молярные соотношения между уровнями F и DHEAS по сравнению с молодыми животными других поведенческих групп. В то же время у старых животных с агрессивным поведением такие внутригрупповые различия не были обнаружены. Минимальные возрастные изменения в активности ГГАС отмечались у обезьян со средним, стандартным типом поведения. Список литературы 1.Alves de Rezende CH, Coelho LM, Oliveira LM, Penha-Silva N. JNHA. 2009; 13: 617-621. 2.Kubzansky LD, Koenen KC, Spiro A, et al. Arch Gen Psychiatry. 2007; 64: 109-116. 3.Goncharova ND, Marenin VYu, Bogatyrenko TN. Curr Aging Sci. 2008; 1: 22-29. 4.Lupien SJ, McEwen BS, Gunnar MR, Heim C. Nature Rev Neurosci. 2009; 10: 434-445. 5.Boyle MP, Kolber BJ, Vogt ShK, et al. J Neurosci. 2006; 26: 1971-1978. 6.Vreeburg SA, Hoogendijk WJ, van Pelt J, et al. Arch Gen Psychiatry. 2009; 66: 617-626. 7.Burke HM, Davis MC, Otte C, Mohr DC. Psychoneuroendocrinology. 2005; 30: 846-856. 8.Genud R, Merenlender A, Gispan-Herman I, et al. Neuropsychopharmacology. 2009; 34: 577-584. 9. Goncharova ND, Lapin BA. Mech Ageing Develop. 2002; 123: 1191-1201. 10.Kemnitz JW, Roecker EB, Haffa ALM, et al. J Med Primatol. 2000; 29: 330-337. 11.Boccia ML, Laudenslager ML, Reite ML. Lab Anim. 1995; 29: 250-257. 12.Goncharova ND, Marenin VY, Oganyan TE. Aging, 2010; 2: 854-866. 13.Van Goozen SHM, Matthys W, Cohen-Kettenis PT, et al. Biol Psychiatry. 1998; 43: 156-158. 14.Soma KK, Scotti M-A, Newman AEM, et al. Front Neuroendocrinol. 2008; 29: 476-489. 15.Fancsik A, Linn DM, Tasker JG. J Neuroscience. 2000; 20: 3067-3075. 16.McDermott R. Ann Amer Acad Polit Social Sci. 2007; 614: 15-33. 17.Goncharova ND. Hormonal function of the adrenal glands in humans and monkeys during hemoblastoses and aging. Bull Exp Biol Med. 1997; 124: 804-807. 18.Orentreich N, Brind JL, Vogelman JH, et al. J Clin Endocrinol Metab. 1992; 75: 1002-1004. 19.Ferrari E, Cravello L, Muzzoni B, et al. Europ J Endocrinol. 2001; 144: 319-329. 20.Khavinson V, Goncharova N, Lapin B. Neuroendocrinol Lett. 2001; 22: 251-254. 21.Rao U, Hammen CL, London ED, Poland RE. Contribution of hypothalamic-pituitary-adrenal activity and stress to vulnerability for smoking in adolescents. Neuropsychopharmacology. 2009; 34: 2721-2732. 22.Goncharova ND, Shmaliy AV, Marenin VYu, Smelkova SA, Lapin BA. Circadian and age-related changes in stress responsiveness of the adrenal cortex and erythrocyte antioxidant enzymes in female rhesus monkeys. J Med Primatol. 2008; 37: 229-238. AGING OF THE HYPOTHALAMIC-PITUITARY-ADRENAL AXIS IN NONHUMAN PRIMATES WITH DEPRESSION-LIKE AND AGGRESSIVE BEHAVIOR. Goncharova ND, Marenin VY, Vengerin AA, Oganyan TE, Lapin BA Research Institute of Medical Primatology of the Russian Academy of Medical Sciences, Sochi, Russia We have investigated aging of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in female rhesus monkeys that differ in adaptive behavior. Plasma cortisol (F) and dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) concentrations under basal conditions and under acute psycho-emotional stress were evaluated in blood plasma of young (6-8 years) and old (20-27 years) female rhesus monkeys with various types of adaptive behavior (aggressive, depression-like, and average). We have found that the age-related changes in the HPA axis of monkeys with depression-like behavior were accompanied by the maximal absolute and relative hypercortisolemia under both basal conditions and stress. Moreover, young aggressive monkeys, in comparison with young monkeys of other behavior groups, demonstrated the highest plasma levels of DHEA-S and the lowest molar ratios between F and DHEA-S. The minimal age-related changes in the HPA axis have been revealed for the monkeys with average type behavior. Thus, age-related dysfunctions of the HPA axis are associated with adaptive behavior of animals. СВЕТОВОЙ РЕЖИМ, МЕЛАТОНИН И РАК В.Н. Анисимов НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, Санкт-Петербург; e-mail: Этот e-mail адрес защищен от спам-ботов, для его просмотра у Вас должен быть включен Javascript Явлением, наиболее существенным для живой природы на Земле, является смена дня и ночи, света и темноты. Вращение нашей планеты вокруг своей оси и одновременно вокруг Солнца отмеряет сутки, сезоны и годы нашей жизни. Все больше сведений накапливается о роли эпифиза (шишковидной железы) и его гормона мелатонина в регуляции биологических ритмов. Физиологический контроль эндокринной функции эпифиза осуществляется в значительной мере световым режимом. Световая информация, воспринимаемая глазами, передается в эпифиз по нейронам супрахиазматического ядра (СХЯ) гипоталамуса через ствол верхней грудной части спинного мозга и симпатические нейроны верхнего шейного ганглия. В темное время суток сигналы от СХЯ вызывают увеличение синтеза и высвобождения норадреналина из симпатических окончаний. Этот нейромедиатор возбуждает рецепторы, расположенные на мембране пинеалоцитов, стимулируя, таким образом, синтез мелатонина. Свет угнетает продукцию и секрецию мелатонина, и поэтому его максимальный уровень в эпифизе и крови человека и животных наблюдается в ночные часы, а минимальный - в утренние и дневные [1]. Молекулярный часовой механизм в СХЯ составлен из взаимодействующих положительной и отрицательной обратных связей регулирующих петель нескольких (по крайней мере, их девять) основных циркадианных «часовых» генов (Per1, Per2, Per3, Cry-1, Cry-2, Clock, Bmal1/Mop3, Tim и др.). Показано, что свет напрямую воздействует на экспрессию некоторых «часовых» генов, обеспечивающих циркадианный ритм. Эти гены регулируют функции клеток, контролирующих экспрессию генов ключевого клеточного цикла деления и генов апоптоза. Мутации в некоторых часовых генах драматически сказываются на многих функциях организма и приводят к развитию различных патологических процессов [1,2]. Изобретение более ста лет назад электричества и искусственного освещения кардинально изменило как световой режим, так и продолжительность воздействия света на человека. Воздействие света в ночное время, часто называемое световым загрязнением, увеличилось и стало существенной частью современного образа жизни, что сопровождается множеством серьезных расстройств поведения и состояния здоровья, включая сердечно-сосудистые заболевания и рак. Согласно гипотезе «циркадианной деструкции», воздействие света в ночные часы нарушает эндогенный суточный ритм, подавляет ночную секрецию мелатонина, что приводит к снижению его концентрации в крови [2-6,8]. Искусственное увеличение продолжительности светового периода в течение дня (на 2-4 часа) приводит у грызунов к увеличению продолжительности эстрального цикла и в некоторых случаях к его нарушению. Если воздействие света увеличить до 24 ч. в сутки, у большинства мышей и крыс в короткие сроки развивается синдром персистирующего эструса. В физиологических условиях этот синдром развивается в более позднем возрасте (у крыс - обычно между 15 и 18 мес. жизни) и затем переходит в анэструс, который является физиологическим эквивалентом климактерического синдрома у женщин. В яичниках у крыс с персистирующим эструсом обнаруживают фолликулярные кисты и гиперплазию тека-ткани яичника, в них отсутствуют желтые тела. Вместо циклической продукции гонадотропинов, пролактина, эстрогенов и прогестерона, характеризующей нормальный репродуктивный период, эти гормоны секретируются ациклически, что приводит к гиперпластическим процессам в молочных железах и матке. Имеются данные, что воздействие света ночью укорачивает продолжительность менструального цикла у женщин с длинным (более 33 дней) циклом. 60% медицинских сестер с регулярным менструальным циклом и частой работой в ночную смену имели менструальный цикл короче 25 дней. Около 70% обследованных медицинских сестер жаловались на редкие или частые дисменореи. У крыс с персистирующим эструсом обнаруживается снижение толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. Установлено, что постоянное освещение приводит к увеличению порога чувствительности гипоталамуса к ингибирующему действию эстрогенов у самок крыс. Этот механизм является ключевым в старении репродуктивной системы, как у самок крыс, так и у женщин. Итак, влияние света ночью приводит к ановуляции и ускорению, связанного с возрастом, выключения репродуктивной функции у грызунов и к дисменорее у женщин. Воздействие постоянного света увеличивает перекисное окисление липидов (ПОЛ) в тканях животных и уменьшает общую антиокислительную и супероксиддисмутазную активности, тогда как применение мелатонина вызывает снижение активности ПОЛ, особенно в головном мозге. Количество рабочих, имеющих ночную работу или работу по сменам, достигает 20 % в США и 15-20 % от общего количества работающих в большинстве стран Европейского Экономического Сообщества. Очевидные проблемы со здоровьем среди сменных рабочих включают нарушения сна, желудочно-кишечные заболевания, увеличение случаев сердечно-сосудистых заболеваний, нарушение метаболизма и толерантности к липидам и, возможно, увеличение случаев развития диабета. Показано, что ожирение, высокий уровень триглицеридов и холестерина, низкая концентрация липопротеинов высокой плотности (ЛВП) обнаруживаются в этой группе чаще, чем у рабочих дневных смен. С другой стороны, имеются доказательства, показывающие, что метаболический синдром, который представлен ожирением, высоким уровнем триглицеридов и холестерина, липопротеинов низкой плотности, гипертонией, сниженной фибринолитической активностью крови, сниженной толерантностью к глюкозе, является не только фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний, но и фактором риска возникновения злокачественных опухолей [8]. Cообщают о гораздо большем количестве смертей от злокачественных новообразований у сменных рабочих, которые работали на производстве не менее 10 лет, по сравнению с рабочими, занятыми только в дневные смены. Cреди медсестер, имеющих стаж более 30 лет и сменную работу, относительный риск РМЖ составлял 1,36 по сравнению с медицинскими сестрами, которые не работали посменно. У медсестер, длительно работающих в ночные смены, был найден сниженный уровень мелатонина и повышенный уровень эстрогенов в крови. Проведенный мета-анализ, основанный на 13 исследованиях, включающих семь исследований работников авиалиний и шесть исследований представителей других профессий, работающих в ночные смены, показал, что общая оценка риска равнялась 1,48. Существенный риск развития РМЖ имели летный состав авиалиний и женщины, работающие в ночные смены. В исследовании, объектом которого были данные о здоровье почти 45 тысяч медицинских сестер в Норвегии, было установлено, что показатель дополнительного риска РМЖ у работавших по ночам в течение 30 и более лет составил 2,21 [8]. Важной находкой стало установление совпадения карт глобального распределения интенсивности светового загрязнения и рака молочной железы и простаты у человека [7]. Анализ данных, представленных в монографиях Международного агентства по изучению рака (МАИР) Всемирной организации здравоохранения (Лион, Франция) «Рак на пяти континентах», показал существенную положительную корреляцию между географической широтой и частотой рака молочной железы, толстой кишки и матки [4]. Смертность от рака молочной железы среди коренных жителей Аляски (эскимосов, индейцев и алеутов) утроилась с 1969 года, что связывают с нарастающей индустриализацией региона. Нами получены существенные экспериментальные доказательства ускорения старения и увеличения риска развития ассоциированных с возрастом заболеваний, включая метаболический синдром, сахарный диабет и рак, при воздействии постоянного освещения или естественного светового режима Севера. Количество случаев спонтанных опухолей молочной железы и гибели из-за роста опухоли у мышей разных линий, включая трансгенных HER-2/neu, подвергнутых постоянному освещению, было значительно большим, чем у мышей, содержавшихся при обычном режиме освещения [2,3,5,9]. Спонтанные опухоли обнаруживали раньше и чаще у крыс, содержавшихся при постоянном освещении или естественном освещении Севера [3,9]. Постоянное освещение обладает также активирующим эффектом на химически индуцированный канцерогенез у грызунов. Эти исследования легли в основу признания экспертами МАИР сменной работы и воздействия света по ночам факторами, возможно канцерогенными для человека (группа 2А) [8]. В опытах на различных моделях канцерогенеза было обнаружено, что применение естественного гормона эпифиза мелатонина оказывает угнетающее влияние на развитие опухолей молочной железы, шейки матки и влагалища, кожи, подкожной клетчатки легких, эндометрия, печени, толстой кишки у животных [6], что свидетельствует о значительной широте спектра антиканцерогенного эффекта этого гормона. Получены также убедительные экспериментальные доказательства того, что применение мелатонина препятствует преждевременному старению репродуктивной системы и организма в целом, предупреждает развитие иммунодепрессии, метаболического синдрома и опухолей различных локализаций, вызываемых световым загрязнением [3,6,8]. Определенный оптимизм вызывают публикации о способности мелатонина повышать устойчивость к окислительному стрессу и ослаблять проявления некоторых ассоциированных с возрастом заболеваний людей, таких как макулодистрофия сетчатки, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, гипертоническая болезнь, сахарный диабет. Необходимы всесторонние клинические испытания мелатонина, которые, как нам представляется, существенно расширят его применение для лечения и профилактики возрастных заболеваний и, в конечном счете, преждевременного старения. Актуальной задачей является формирование комплексной Национальной программы, направленной на разработку конкретных рекомендаций по профилактике как преждевременного старения, так и развития ассоциированных с возрастом заболеваний, включая злокачественные новообразования, у населения северных регионов и лиц группы повышенного риска, имеющих сменный характер работы. Литература 1. Анисимов В.Н. Эпифиз, биоритмы и старение организма // Успехи физиол. наук. 2008. T.39, N 4. C. 40-65. 2. Анисимов В.Н. Синдром ускоренного старения при воздействии канцерогенных факторов окружающей среды. Рос. Физиол. ж. им. И.М. Сеченова, 2010. Т.96 № 8, С. 817-833. 3. Анисимов В.Н., Виноградова И.А. Световой режим, мелатонин и риск развития рака // Вопр. онкол., 2006. Т.53, №5. С.491-498. 4. Борисенков М.Ф., Анисимов В.Н. Риск рака у женщин: возможная связь с географической широтой и некоторыми экономическими и социальными факторами // Вопр. онкол. 2011. Т.57. № 3. С. 343-354. 5. Anisimov V.N. Light pollution, reproductive function and cancer risk // Neuro Endocrinol. Lett. 2006. Vol. 27. N 1-2. P. 35-52. 6. Anisimov V.N., Popovich I.G., Zabezhinski M.A., Anisimov S.V., Vesnushkin G.M., Vinogradova I.A. Melatonin as antioxidant, geroprotector and anticarcinogen // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol.1757. P. 573-589. 7. Kloog I., Hailm A., Stevens R.G., Portnov B.A. Global co-distribution of light at night (LAN) and cancers of prostate, colon, and lung in men // Chronobiol Int. 2009. Vol.26. P. 108-125. 8. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Vol.98. Lyon: IARC. 2010.- 804 p. 9. Vinogradova I.A., Anisimov V.N., Bukalev A.V. et al. Circadian disruption induced by light-at-night accelerates aging and promotes tumorigenesis in rats // Aging. 2009. Vol.1, No 10. P. 855-865. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ФАРМАКОКОРРЕКЦИИ ГОРМОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ В ЖЕНСКОМ ОРГАНИЗМЕ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НА ЖИВОТНЫХ Ордян Н.Э.,* Гончарова Н.Д.**, Пивина С.Г.*, Смелкова С.А.** *Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия ** НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Проблема психоэмоционального стресса – одна из актуальнейших медико-биологических и социальных проблем современного общества. Выраженное ухудшение здоровья населения в значительной мере связывают с повышенной психогенной нагрузкой на организм человека. Испытываемые в молодом возрасте чрезмерные или достаточно частые психогенные нагрузки приводят к развитию стресс-зависимой патологии и преждевременному старению организма, а в пожилом возрасте – к прогрессированию возрастных заболеваний и инвалидности [Судаков, 2008; Шамолина и др., 2009, Goncharova et al., 2010]. В этом отношении особое место занимает проблема психоэмоционального стресса, испытываемая матерями в период беременности, что отражается не только на общем развитии их потомков женского пола, но и приводит к различным гормональным нарушениям у них в последующей жизни. Важнейшим звеном в развитии психоэмоционального стресса является активация гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС), которая осуществляет сложные связи между нервной системой и периферическими органами и системами в ответ на стрессовые воздействия с целью адаптации организма. Для этой гормональной оси характерно наличие циркадианной активности, касающейся как базальной и стресс-индуцированной активности, так и ее регуляции по механизму отрицательной обратной связи. В течение онтогенеза суточный ритм секреции гормонов и нейрогормонов ГГАС претерпевает существенную перестройку, что может усугубляться в результате стрессовых воздействий в пренатальный период развития, а также в старческом возрасте [Ордян, Пивина, 2003; Goncharova, 2009; Koehl et al., 1999; Lo et al., 2006]. Изучение характера возрастных изменений суточного ритма активности ГГАС имеет важное теоретическое и практическое значение. Это обусловлено тем, что кортикостероиды принимают участие в регуляции функциональной активности различных органов и физиологических систем и интегрируют их деятельность в условиях стресса, а изменения циркадианного ритма активности ГГАС могут приводить к нарушениям в функционировании других органов и систем и способствовать возникновению и/или прогрессированию возрастной патологии [Гончарова и др., 2002; Goncharova, 2009; Lupien et al., 2002]. В связи с эти особую актуальность приобретает поиск подходов к коррекции подобных нарушений активности этой важнейшей гормональной оси. Следует отметить, что подобного рода экспериментальные исследования выполняются, как правило, на грызунах (крысах, мышах) или на лабораторных приматах. Последние наиболее близки человеку по своим физиологическим характеристикам, а грызуны благодаря возможности использовать большие объемы животных являются излюбленным объектом эндокринологов. Сопоставление данных, полученных на разных лабораторных животных, несомненно, имеет важное практическое значение, т.к. позволяет получить целостную картину гормональных изменений на разных этапах онтогенеза применительно к человеку и наметить пути коррекционных воздействий. В связи с этим целью настоящего исследования явилось сравнение изменения активности ГГАС в процессе онтогенетического развития у самок крыс и самок макак резус и поиск путей фармакокоррекции нарушений функциональной активности этой гормональной системы, вызванной пренатальным стрессом или старением. 1. Реакция ГГАС на острое психоэмоциональное стрессовое воздействие в зависимости от времени суток у молодых и старых самок макак резус и самок крыс. Объектом исследования явились клинически здоровые самки макак резусов (Macaca mulatta) в возрасте 6-8 лет (молодые половозрелые) и 19-27 лет (старые), содержащихся в питомнике Научно-исследовательского института медицинской приматологии РАМН, а также самки крыс линии Вистар в возрасте 2,5-3 мес (молодые половозрелые) и 24 мес (старые), выращенные в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН. Кроме того, в экспериментах использовали молодых и старых самок крыс, рожденных от матерей, подвергавшихся психоэмоциональному стресу (иммобилизация в течение 1 ч) с 15-19 день беременности. С целью моделирования острого психоэмоционального стресса самок макак резусов обеих возрастных групп подвергали нежесткой иммобилизации в метаболических клетках в течение 2-х часов. Иммобилизация животных проводилась дважды (в 9.00 и 15.00) с интервалами между повторными иммобилизациями в 2-3 недели. Взятие образцов крови проводили до начала иммобилизации и через различные временные промежутки после начала иммобилизации. У самок крыс исследовали динамику развития гормональной стрессорной реакции в ответ на 20-минутную иммобилизацию, которую проводили в 10.00 и 16.00. Кроме того, у крыс исследовали регуляцию ГГАС по механизму отрицательной обратной связи с помощью 2-х дневного дексаметазонового теста. Содержание кортизола в плазме крови определяли иммуноферментным методам с использованием коммерческих наборов («Алкор-Био», Санкт-Петербург), а кортикостерона – радиоиммунологическим методом с использованием антисыворотки (Sigma) и [1,2,6,7-3Н]-кортикостерона с удельной активностью 76,5 Кю/ммоль (NEMTM Life Science Products, Boston, USA). Уровень гормонов представлен в нмоль/л. Проведенные исследования показали, что у молодых самок макак резусов выявлено достоверное более выраженное увеличение концентрации кортизола через 120 мин после начала стрессового воздействия в 15.00 по сравнению с соответствующими значениями в 9.00(1220±80 и 1670±70, соответственно, p<0,05). У старых животных значимые циркадианные различия в величине подъема уровня кортизола отсутствовали (1240±105 и 1360±70, соответственно). При этом базальный уровень кортизола имел сходную величину как у старых и молодых животных, так и в утреннее и послеполуденное время. Различия в стрессорной реакции ГГАС молодых и старых самок крыс были выявлены как в динамике гормонального стрессорного ответа в утренние часы, так и в величине стрессорного подъема кортикостерона. У молодых самок крыс базальный уровень кортикостерона в утренние часы был достоверно ниже, чем в вечерние (406±70 и 608±90, p<0,05, соответственно). У старых животных базальный уровень гормона в утренние часы повышался и не отличался от такового в вечернее время (598±47 и 532±67, соответственно). С возрастом менялась и динамика стрессорного ответа ГГАС. У старых самок по сравнению с молодыми обнаружен более низкий максимальный уровень кортикостерона в ответ на иммобилизационный стресс и пролонгация стрессорного выброса гормона. Последнее свидетельствует о снижении чувствительности системы к сигналам обратной связи, что подтвердилось в дексаметазоновом тесте, где у старых животных торможение стрессорной активность ГГАС отсутствовало, в отличие от контрольных животных, у которых дексаметазон вызывал торможение и базальной и стрессорной активности системы. Следует отметить, что самки крыс, рожденные от матерей, подвергавшихся хроническому психоэмоциональному стрессу в последнюю треть беременности, отличались от контрольных животных повышенной базальной и стрессорной активностью ГГАС в молодом возрасте. По мере старения у пренатально стрессированных самок обнаружено постепенное снижение базального уровня кортикостерона и чувствительности системы к сигналам обратной связи, что наблюдалось нами у этих крыс уже в годовалом возрасте. Таким образом, проведенные исследования показали, что как у самок макак резус, так и у самок крыс по мере старения происходят изменения активности ГГАС, заключающиеся в отсутствие у старых животных суточной динамики активности системы. Однако если у макак резус это касалось стрессорного подъема кортизола, то у крыс исчезала суточная динамика в базальном уровне кортикостерона. Вместе с тем, у старых макак резус и у крыс по сравнению с молодыми животными стрессорный ответ ГГАС был снижен. Кроме того, нами показано ускоренное старение системы у пренатально стрессированных самок крыс. Как известно, глюкокортикоиды оказывают токсическое действие на области гиппокампа, ответственные за регуляцию ГГАС по механизму обратной связи [McEwen, Magarinos, 1997]. Возможно, именно этим объясняется истощение этой системы с возрастом у пренатально стрессированных животных. Исходя из полученных данных, нами предпринята попытка фармакокоррекции нарушений активности ГГАС у старых самок макак резус, а также базальной и стрессорной активности системы у молодых пренатально стрессированных самок крыс. 2. Применение эпиталона для восстановления возрастных нарушений в стресс-реактивности ГГАС самок макак резус. С этой целью старым (19 – 27 лет) животным вводили эпиталон (10 мкг/животное в сутки в течение 14 суток, внутримышечно) в качестве активатора пинеальной секреции мелатонина. Эпиталон (тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly) был синтезирован в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [Хавинсон, Малинин, 2002]. Другим старым (19 – 27 лет) животным, а также молодым (6 – 8 лет) животным в течение 14 дней вводили плацебо (0,9% раствор натрия хлорида). На 7 и 14 дни введения эпиталона либо плацебо все животные подвергались двухчасовой иммобилизации, соответственно, в 9.00 ч и 15.00 ч. Взятие образцов крови проводили до начала иммобилизации (0) через различные временные промежутки после начала иммобилизации. Проведенные исследования показали, что у старых животных, получавших эпиталон, выявлялся выраженный циркадианный ритм в стресс-реактивности коры надпочечников, который носил характер, сходный c циркадианным ритмом стресс-реактивности кортизола у молодых животных, получавших плацебо. Наряду с восстановлением циркадианного ритма стресс-реактивности коры надпочечников у старых животных, получавших эпиталон, отмечалось восстановление стресс-реактивности коры надпочечников в послеполуденное время. Так, у молодых контрольных животных концентрация кортизола через 120 мин после иммобилизации в 15.00 составляла 195±14% от исходного уровня, в то время как у старых контрольных животных - 149±10% животных (p<0,05 против молодых), а у животных, получавших эпиталон, – 220+29 % (p<0,05 против старых контрольных). Таким образом, результаты этих экспериментов указывают на восстанавливающий эффект эпиталона как на циркадианную периодичность стресс-реактивности коры надпочечников, так и на величину подъема уровня кортизола у старых животных в ответ на стрессовое воздействие. Восстанавливающий эффект эпиталона на активность ГГАС, возможно, обусловлен восстановлением концентрации мелатонина в плазме крови и тканях мозга за счет увеличения пинеальной секреции мелатонина в вечернее время с последующим модулированием чувствительности кортикотрофов аденогипофиза к аргинину-вазопрессину с учетом времени суток. Этот вывод согласуется с данными, полученными в предыдущих исследованиях [Goncharova, 2009], в которых были выявлены значимые возрастные различия в концентрации мелатонина в плазме крови у самок макак резус в 19.00 с более высокими значениями у молодых животных. В то же время, отмечалось увеличение концентрации мелатонина у старых обезьян на фоне введения эпиталона, до уровня мелатонина у молодых контрольных животных в это же время суток. 3. Применение серотонинотропных лиганд у самок крыс для коррекции нарушений активности ГГАС, вызванных пренатальным психоэмоциональным стрессом. Было показано, что введение антагониста 5-НТ2А/2С рецепторов серотонина кетанзерина или агониста 5-НТ1А рецепторов 8-ОН-DPAT оказывает выраженный анксиолитический и антидепрессивный эффект у самок крыс в зависимости от стадии полового цикла [Федотова, 2010]. Мы предположили, что такой положительный эффект серотонинотропных лиганд может быть обусловлен его влиянием на активность ГГАС. В связи с этим для коррекции нарушений активности ГГАС, вызванных пренатальным стрессом, половозрелым самкам крыс, рожденным от стрессированных матерей, внутрибрюшинно вводили кетанзерин (Sigma) в дозе 0,1 мг/кг веса, подкожно 8-ОН-DPAT (Sigma) в дозе 0,05 мг/кг веса или физиологический раствор в течение 14 дней. Далее крыс подвергали 20-мин иммобилизационному стрессу и из хвостовой вены отбирали пробы крови до начала иммобилизации (базальный уровень) и 20, 60 и 180 мин после начала стрессирования. В полученных пробах определяли уровень кортикостерона. Проведенные исследования показали, что введение 8-ОН-DPAT пренатально стрессированным животным снижает базальный уровень кортикостерона в крови по сравнению с крысами, которым вводили физиологический раствор (343±43 и 569±55, p<0,05, соответственно). Причем по этому показателю пренатально стрессированные животные, получавшие терапию, приближались к контрольным крысам, у которых базальный уровень кортикостерона в крови составил 409±70. Кроме того, у пренатально стрессированных крыс с введением кетанзерина обнаружено торможение развития стрессорной реакции и снижение максимального выброса кортикостерона в кровь, которое наблюдалось через 60 мин после начала стрессирования по сравнению с животными, которым вводили физиологический раствор. Следует отметить, что оба исследованных серотонинотропных лиганда оказывали благоприятное действие и на уровень тревожности, а также на депрессивноподобное поведение пренатально стрессированных самок крыс, что подтверждает нашу точку зрения о вовлеченности гормонов нейрогормонов ГГАС в поведенческие эффекты пренатального стресса у особей женского пола. Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ № 09-04-01765 Литература 1.Гончарова Н.Д., Лапин Б.А., Хавинсон В.Х. Возрастные нарушения эндокринных функций и возможные пути их коррекции // Бюл. экспер. биол., 2002. Т. 134, № 11. С. 484-489. 2.Судаков К.В. Эволюция концепции стресса // Вестн. Рос. АМН. 2008. № 11. С. 59-66. 3.Oрдян Н.Э., Пивина С.Г. Характеристика поведения и стрессореактивности гипофизарно-адреналовой системы пренатально стрессированных крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2003. Т. 89, № 1. С. 52-59. 4.Федотова Ю.О. Влияние кетансерина на тревожно-депрессивноподобное поведение самок крыс в ключевые фазы полового цикла // Росc. Физиол. Журн. им. И.М. Сеченова. 2010. Т. 96, № 4. С. 426-432. 5. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Механизмы геропротекторного действия пептидов // Бюл. экспер. биол., 2002. № 1. С. 4-10. 6.Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Ордян Н.Э. Изменение активности гипофиз-адренокортикальной и репродуктивной систем пренатально стрессированных самок крыс в процессе старения // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2009. Т. 95, №. 9. С. 984-992. 7. Goncharova N. D., Shmaliy A. V., Marenin V. Y., Smelkova S. A., Lapin B. A. Circadian and age-related changes in stress responsiveness of the adrenal cortex and erythrocyte antioxidant enzymes in female rhesus monkeys // Journal of medical primatology.  2008. Vol. 37, No 5. P. 229-238. 8. Goncharova N.D. The Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis in Nonhuman Primates: Circadian Rhythms of Stress-Responsiveness and Aging //In: Primatology: Theories, Methods and Research (Editors: Emil Potocki and Juliusz Krasiсski), NY, Nova Science Publishers, 2009, P. 29-52. 9. Goncharova N.D., Marenin V.Yu., Oganyan T.E. Aging of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in nonhuman primates with depression-like and aggressive behavior //Aging (NY, Albany). 2010. Vol. 2, No 11. P. 854-866. 10. Koehl M., Darnaudery M., Dulluc J., Van Reeth O., Le Moal M., Maccari S. Prenatal stress alters circadian activity of hypothalamo-pituitary-adrenal axis and hippocampal corticosteroid receptors in adult rats of both gender // J. Neurobiol. 1999. V. 40. P. 302-315. 11. Lo M.-J., Kau M.-M., Wang P.S. Effect of aging on corticosterone secretion in diestrous rats // J Cell Biochem. 2006. V. 97. P. 351-358. 12. Lupien S.J., Wilkinson C.W., Briere S. et al. The modulatory effects of corticosteroids on cognition: studies in young human populations // Psychoneuroendocrinology. 2002. Vol. 27. P. 401-416. 13. McEwen B.S., Magarinos A.M. Stress effects on morphology and function of the hippocampus // Ann NY Acad Sci. V. 82. P. 271-284. 1997. NEW APPROACHES TO PHARMACOCORRECTION OF HORMONAL DISORDERS IN A FEMALE ORGANISM AT DIFFERENT STAGES OF ONTOGENESIS: EXPERIMENTAL INVESTIGATION ON ANIMALS Ordyan N.E.*, Goncharova N.D.**, Pivina S.G.*, Smelkova S.A.** * Pavlov Institute of Physiology, RAS, St. Petersburg, Russia **Research Institute of Medical Primatology, RAMS, Russia The investigation was aimed at a comparative study of changes in the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis during the ontogenesis in female rats and rhesus monkeys and to attempts to find new approaches to pharmacological correction of disorders in the function of this hormonal system as a result of prenatal stress or aging. It was shown that in the process of aging female rhesus monkeys and rats show the lack of diurnal dynamics in the activity of the HPA axis. Additionally, in comparison with young animals, old rhesus monkeys and rats demonstrated a decreased responsiveness of the HPA axis to acute stress. Moreover, the accelerated aging of the system in female rats stressed in the prenatal period was shown; it was probably conditioned by higher activity of the HPA axis in young animals. The effectiveness of epitalon for correction of age-related disorders in the activity of the HPA axis in old rhesus monkeys was shown. It was also established that the use of serotonintropic ligands is effective for correction of activity of the HPA axis induced by prenatal psycho-emotional stress in female rats. ИССЛЕДОВАНИЕ ГРУППОВОГО ПОВЕДЕНИЯ ПРИ НАЗЕМНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ПИЛОТИРУЕМОГО ПОЛЕТА К МАРСУ Виноходова А.Г., Хананашвили М.М., Еськов К.Н. ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия Среди задач по обеспечению жизнедеятельности в околоземном пространстве, включая длительное пребывание на его стационарных объектах, а также принимая во внимание перспективы освоения других планет, все возрастающее значение приобретает поиск оптимальных условий взаимодействия членов космических экипажей в исключительно рандомизированной среде – полной потоков неизвестной информации, прежде всего, психогенной природы. Однако решение этого вопроса в условиях реального космического полета затруднено ограничениями не только технического, но и этического характера, что подчеркивает важность такого исследования в наземном эксперименте, позволяющем частично преодолеть негативное влияние вышеупомянутых ограничений и прогнозировать границы флуктуаций возможного потока информации, участвующей в формировании группы, в реальной внеземной среде. Некоторым результатам таких наземных исследований посвящена настоящая работа, но, прежде всего, представляется нужным отметить, что в своих наблюдениях при осмыслении полученных результатов мы учитывали исследования Института медицинской приматологии РАМН, посвященные внутривидовому взаимодействию приматов, получившие мировую известность, в чем трудно переоценить роль академика Бориса Аркадьевича Лапина – выдающегося приматолога мирового значения. Применительно к предполагаемым условиям пилотируемого полета к Марсу (сверхдлительность, автономность, ограничение возможности допоставки жизненно важных ресурсов, измененный режим коммуникаций с Землей и др. (Григорьев А.И. с соавт., 2002)) был сформулирован ряд принципов, направленных на оптимизацию межличностного взаимодействия в изолированной малой группе с учетом новых условий, прежде всего, повышения автономности жизнедеятельности экипажа (Хананашвили М.М. с соавт., 2008). В рамках развиваемого представления о биологически положительном стрессе (Хананашвили М.М. 2002, 2007) ранее было высказано предположение о том, что формирование оптимальной иерархической структуры особей в группе, в том числе выдвижение лидера группы, является результатом проявления саморегуляции группового поведения особей – одного из механизмов жизнеобеспечения группы. Главным психологическим фактором полета к Марсу может считаться автономность существования экипажа, которая с точки зрения группового функционирования рассматривается нами как проблема самоорганизации и самоуправления. Самоорганизация на уровне группы (саморегуляция – на индивидуальном уровне) определяют адаптивность и стресс-устойчивость малой группы в автономных экстремальных условиях космического полета. Эти положения явились основополагающими для разработки новых подходов к изучению и оптимизации группового поведения применительно к предполагаемым условиям пилотируемой марсианской экспедиции. На основании исследований, проведенных нами ранее в условиях наземного моделирования факторов космического полета (Виноходова А.Г. с соавт., 2005, 2007; Еськов К.Н., 2005), были выделены три направления исследований оптимизации межличностного взаимодействия в изолированной малой группе соответственно этапам формирования и функционирования групповой психологической структуры: Первое направление связано с этапом отбора и комплектования группы. На этом этапе методы оптимизации межличностного взаимодействия основываются на учете размера и композиции группы (гендерный состав, возраст участников, национальность, опыт пребывания в условиях изоляции и т.п.), оценке психологической совместимости при подборе состава изолированной малой группы, изучении способности к саморегуляции и устойчивости к стрессу при принятии групповых решений, учете мотивационной направленности членов группы. Одной из важнейших задач для оптимизации взаимодействия между членами изолированной малой группы является отбор лидера группы. Вторая группа подходов к оптимизации межличностного взаимодействия в условиях изоляции основывается на изучении структурно-функциональных характеристик малой группы и включает в себя исследование иерархической (формальной) структуры, функционально-ролевого распределения по типу «лидер – ведомый», эмоциональных отношений и групповой совместимости/сплоченности. Третье направление связано с реализацией принципа управления конфликтами в условиях, максимально приближенных к условиям реального космического полета. Разработанные подходы были частично апробированы при подготовке и проведении 105-суточного эксперимента по моделированию начального этапа пилотируемого полета к Марсу (проект «Марс-105»), организованном в ГНЦ РФ - ИМБП РАН в 2009 году (Виноходова А.Г. с соавт., 2010). В нем принимал участие международный экипаж из шести человек – четырех россиян и двух представителей Европейского космического агентства в возрасте от 25 до 40 лет. В ходе эксперимента экипаж выполнял обширную научную программу, включавшую более 70 экспериментов, реализовывал мероприятия по профилактике воздействия моделируемых неблагоприятных факторов (физические тренировки), осуществлял круглосуточное дежурство по экспериментальному комплексу. Автономные условия существования моделировались путем ограничения имеющихся у экипажа ресурсов (питания, расходных материалов и т.п.) и отсутствием дооснащения, минимизацией коммуникаций с наземным центром управления. Целью нашего исследования являлась оценка эффективности ряда новых критериев группового и индивидуального психологического отбора для включения в состав пилотируемой марсианской экспедиции. Задачами исследования были: 1) оценка членов экипажа по следующим параметрам - способность к саморегуляции, устойчивость к стрессу; способность к лидерству; изучение динамики указанных параметров в ходе 105-суточной изоляции; 2) исследование эффективности межличностного взаимодействия и динамики функционально-ролевого распределения (по типу «лидер-ведомый»; 3) изучение динамики психологической совместимости экипажа в ходе изоляции. В исследовании нами проверялись следующие гипотезы: 1. Повышение гетерогенности состава экипажа является фактором риска при формировании единого сплоченного экипажа. 2. Оптимальное функциональное состояние лидера, основанное, прежде всего, на его устойчивости к стрессу и способности к саморегуляции, может оказывать решающее влияние на сплоченность группы и эффективность межличностного взаимодействия. Методы исследования Нами использовались следующие оригинальные методы исследований, разработанные в ГНЦ РФ – ИМБП РАН для отбора космонавтов: 1. Компьютеризированная методика «Релаксометр» для оценки способности к психофизиологической саморегуляции и устойчивости к стрессу. В данной методике на экран компьютера выводится актуальное значение электрокожного сопротивления (в кОм) и обследуемый должен за 5 минут, расслабляясь привычным ему способом, изменить (в сторону повышения) это значение. Регистрировались и рассчитывались следующие параметры: величина электрокожного сопротивления (ЭКС) в начале и в конце выполнения теста «Релаксометр»; средняя величина ЭКС за весь период теста; абсолютное изменение ЭКС (кОм) и относительное изменение ЭКС (%) – параметры, отражающие динамику ЭКС при выполнении теста «Релаксометр» и характеризующие способность к произвольной релаксации. 2. Компьютеризированное устройство «Гомеостат» для оценки эффективности межличностного взаимодействия при выполнении группой взаимозависимой деятельности и выявления распределения ролей по типу «лидер-ведомый». Устройство «Гомеостат» состоит из 4-х пультов для обследуемых и блока их подстыковки, а также персонального компьютера. Обследуемым предъявлялись для решения гомеостатические задачи с возрастающим уровнем сложности, который определялся величиной коэффициента взаимовлияния членов группы друг на друга. На решение одной задачи отводилось 180 сек. Задача могла быть решена только в результате согласованных действий всей группы. При определенном уровне коэффициента взаимовлияния задача решалась, только если один из членов группы действовал определенным образом, управляя остальными операторами, то есть демонстрировал «тактику лидера». Тест «Релаксометр» и методика «Гомеостат» применялись в ходе фонового исследования и в периоде после окончания изоляции группы. Результаты исследования На Рис. 1 представлено условное ранжирование добровольцев – участников эксперимента «Марс-105» по критерию способности к произвольной саморегуляции своего состояния (абсолютное изменение (повышение) ЭКС в тесте «Релаксометр»). Эти данные свидетельствуют о том, что наилучшими способностями к произвольной саморегуляции, которые достоверно (по данным наших более ранних исследований) связаны с более высоким уровнем устойчивости к стрессу в экстремальных условиях, обладают обследуемые B и E. Обследуемые С и А характеризуются средними показателями способности к произвольной саморегуляции своего состояния. Обследуемые D и F – практически не способны произвольно расслабиться и изменить свое состояние. Это позволяет сделать вывод о недостаточной устойчивости этих обследуемых к стрессу. Данные, полученные по методике «Гомеостат» позволяют оценить способности к эффективному межличностному взаимодействию при выполнении совместной взаимозависимой деятельности, а также предпочитаемую тактику поведения – «тактику лидера» или «тактику ведомого». Из шести членов экипажа было сформировано три тестируемые подгруппы, по четыре оператора в каждой. Таким образом, все шестеро обследуемых были задействованы практически одновременно и имели равную возможность взаимодействовать между собой в разных сочетаниях. Рис. 1. Условное ранжирование обследуемых – участников эксперимента «Марс-105» по способности к произвольной саморегуляции своего состояния Всего за два обследования (до и после изоляции) экипажу было предъявлено 32 инструментальные гомеостатические задачи зачетной степени сложности. Из них были решены 11 задач. На Рис. 2 представлена диаграмма ориентировочного ранжирования участников эксперимента по степени выраженности «лидерских» качеств, проявленных ими в процессе группового взаимодействия при решении совместных гомеостатических задач. Членов экипажа «Марс-105» можно условно (внутри данной группы) разделить следующим образом: операторы F и B - демонстрировали гомеостатическое «лидерство» близкое к значимому; операторы C и D - поведение квалифицируется как неопределённое, промежуточное; операторы A и E - тактика поведения близка тактике гомеостатического «ведомого». Следует отметить повышенную индивидуальную активность операторов В и Е (значения показателя WF 24,9 и 21,7 соответственно) и низкую оператора С (WF=5,7); оптимальное значение показателя - 20. Рис. 2. Условное ранжирование участников эксперимента по степени выраженности «лидерских» качеств и общей активности По результатам нашего исследования были выявлены члены группы, наиболее устойчивые к стрессу, по параметрам способности в произвольной саморегуляции своего состояния. Некоторые члены экипажа показали недостаточную стресс-устойчивость. При исследовании эффективности межличностного взаимодействия и лидерских способностей, были определены подгруппы, наиболее успешно выполнявшие совместную деятельность (наиболее совместимые), а также члены экипажа, наиболее способные к управляющим лидерским функциям. Изучение структуры межличностных отношений в экипаже показало, что в середине периода изоляции (второй месяц) в исследуемой группе произошло снижение сплоченности, и имела место определенная конфликтная напряженность, которая в последующем периоде привела к разделению экипажа на устойчивые пары, предпочитающие друг друга. Это, скорее всего, было обусловлено недостаточно эффективной функционально-ролевой структурой группы, отсутствием сильного лидера, объединяющего экипаж. Таким образом, характеристики лидера и его состояние представляются важнейшими факторами, определяющими адаптивные способности группы в условиях изоляции. Психофизиологическое состояние и стресс-устойчивость лидера, основанные на способности к саморегуляции, являются факторами, оказывающими существенное влияние на структуру внутригрупповой иерархии и, в конечном счете, на способность группы к эффективному выполнению ее задач. Исследование поддержано грантом РФФИ (проект № 10-06-00566а). Литература 1. Виноходова А.Г., Быстрицкая А.Ф., Смирнова Т.М. Способность к психической саморегуляции как фактор устойчивости к стрессу в экстремальных условиях космического полета. // Авиакосм. и экол. мед. 2005. № 5. С.14-18 2. Виноходова А.Г., Быстрицкая А.Ф., Смирнова Т.М. Применение метода оценки индивидуальной стресс-устойчивости космонавтов в целях профессионального отбора специалистов для выполнения сложных и ответственных видов деятельности. // Авиакосм. и экол. мед. 2007. № 6/1. С.20-22. 3. Виноходова А.Г., Гущин В.И., Еськов К.Н., Хананашвили М.М. Групповой психологический отбор и оптимизация межличностного взаимодействия в эксперименте с 105-суточной изоляцией //Авиакосмическая и экологическая медицина. 2010. № 4. С.5-10. 4. Григорьев А.И., Демин Е.П., Быстрицкая А.Ф., Гущин В.И., Виноходова А.Г. Некоторые особенности организации жизнедеятельности экипажа марсианской экспедиции. // Авиакосм. и экол. мед. 2002. Т. 36. № 5. С. 3–7. 5. Еськов К.Н. Групповые психологические исследования в длительных наземных экспериментах с использованием методики «Гомеостат». // Авиакосм. и экол. мед. 2005. Т. 39. № 5. С. 19-23. 6. Хананашвили М.М. Биологически положительный психогенный (информационный) стресс – В монографии «Дизрегуляционная патология» (под ред. Г.Н. Крыжановского) – М., Изд. Медицина, 2002. 7. Хананашвили М.М. Проблема переходного состояния от нормы к патологии в учении о высшей нервной деятельности. // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007. №2. С. 3-10. 8. Хананашвили М.М., Виноходова А.Г., Гущин В.И., Сальницкий В.П. Новое в психологическом отборе, подготовке и комплектовании экипажа применительно к условиям пилотируемой экспедиции на Марс. // Вестник РГНФ. 2008. № 1. С. 137-146. STUDY OF GROUP BEHAVIOR UNDER SIMULATED CONDITIONS OF PILOTED SPACE FLIGHT TO MARS Vinokhodova A.G., Khananashvili M.M., Eskov K.N. State Research Center of Russian Federation – Institute for Bio-medical Problems of RAS, Moscow, Russia The paper is presented some results of group behavior investigations under simulated conditions of principal limitations, which are proper to an inter-planetary space flight. Searching for new approaches to organization of psychological support of Martian mission, three areas of investigations in purpose to optimize interpersonal interaction in isolated small group (space crew) were proposed: First one is devoted to the phase of group selection, taking into account such parameters as group size and composition (gender, age, nationality, experience and so on). The second approach includes the study of group hierarchy, functional and role distribution by type “leader – follower”, emotional relations and group cohesiveness. Third area of investigations is connected with resolution of conflicts in group under conditions, which are maximally close to real space flight. The selection of group leader is one of the most important issues for optimization of interaction between the members of a small isolated group. For this purpose we have been taking into consideration the conception, proposed by M.M. Khananashvili, about biologically positive stress as a factor of development of hierarchical structure in a group, including apparition of a leader, and about self-regulation as a mechanism of group behavior organization, as well. New approaches to optimization of group behavior under isolation conditions were partly applied in 105-days ground simulation of initial phase of piloted flight to Mars – “Mars-105” project, which took place in Moscow in 2009. The international crew of 6 persons – 4 Russians and 2 Europeans, aged by 25-40 years – participated in this experiment. To study the effectiveness of new criteria for group selection, we used the following original methods, which were created for psychological selection of cosmonauts: 1) Computerized test “Relaxometer” for assessment of ability for psycho-physiological self-regulation and stress tolerance. 2) “Homeostat” hardware and software equipment for assessment of interpersonal interaction effectiveness and role distribution by type “leader – follower”, while solving of group cooperative tasks. The results of the study demonstrated the efficiency of proposed approach to crew selection in the context of future piloted flight to Mars, based on some new criteria, such as tolerance to informational stress and optimal role distribution, as well. The results showed that psycho-physiological state and stress-tolerance of the leader (due to his ability for self-regulation as a manifestation of biologically positive stress) are the main factors, influencing the functional-role structure and capacity of the group to perform the tasks under space flight conditions. ИМИТАЦИЯ НА ОБЕЗЬЯНАХ ЛУЧЕВОЙ ПАТОЛОГИИ, ВОЗМОЖНОЙ ПРИ МЕЖПЛАНЕТНЫХ ПОЛЕТАХ ЧЕЛОВЕКА (ретроспекивный анализ). Яковлева Л. А., Джикидзе Э. К. НИ ИМП РАМН, Россия. Во время межпланетных полетов, вне защитного слоя магнитосферы земли, организм космонавта будет постоянно находиться под воздействием малых доз галактического космического излучения (ГКЛ) и солнечного космического излучения (СКЛ). Во время солнечных вспышек мощность излучения будет резко возрастать. Лучевая патология является одной из наиболее актуальных проблем для длительного пребывания человека в «открытом космосе». Лучевой процесс у животных разных видов и человека подчинён общим закономерностям. У приматов (обезьян и человека) лучевая патология наиболее сходна из-за сходства их цитогенетической радиочувствительности и нозологического профиля инфекционных болезней, закономерно наслаивающихся на лучевой процесс. При длительном фракционном облучении малыми дозами у обезьян развивалась хроническая лучевая патология, скорость развития которой зависит от величины однократного воздействия и мощности дозы, т. е. от общего количества поглощенной энергии. При однократном тотальном воздействии ионизирующего излучения из внешнего источника (при переносимых дозах радиации – сублетальных или минимальной летальной при условии защиты) возникает острая лучевая болезнь (ОЛБ). В настоящем сообщении приводятся результаты исследований , проведенных в Сухумском питомнике в 60-е годы прошлого столетия, на 332 обезьянах (длительное фракционное облучение на 148 обезьянах - 48 м. резусов, 30 м. ассамских, 70 п. гамадрилов) и ОЛБ на 184 м. резусах. Тотальное облучение проводилось либо на рентгеновской установке РУМ-3 (фильтры Cu-0,5mm, Al-1,1mm, напряжение 180кв, сила тока 15мА, мощность дозы 16-25р/мин) либо, преимущественно, на гамма-установке (общая мощность заряда Co60, равная 4 кг-экв. радия, мощность дозы 82р/мин.). Основным действием ионизирующей радиации является нарушение течения регенераторных процессов в связи с повреждением ДНК клеток, что особенно проявляется в тканях с постоянным обновлением: эпителий желудочно-кишечного тракта, клетки костного мозга и лимфоидных образований, эпителий герминативных органов. Глубокая депрессия иммунитета и сосудистые расстройства приводят к развитию геморрагического диатеза (ГД) и ареактивному некротически-гемморагическому характеру воспаления. Лучевая патология обезьян при длительном фракционном облучении. Для воспроизведения на обезьянах (Macaca mulatta и Papio hamadryas) хронической лучевой патологии использовалось ежедневное фракционное длительное облучение животных в однократных дозах 4-х уровней: 0, 01 Зв, 0,03-0,04 Зв, 0,052–0,057 Зв и 0,16-0,26 Зв. При фракционном облучении 92 животных в дозах 0,01–0,04 Зв в сутки (мощность дозы 0,08 – 0, 05р/мин.) в течение нескольких лет, развивался симптомокомплекс со значительным полиморфизмом соматических нарушений, который может быть охарактеризован как хронический лучевой процесс, при котором классическая лучевая болезнь у обезьян не возникала. В периферической крови дефицит форменных элементов был слабо выражен. Однако, постоянными были прогрессирующая потеря массы тела и анемия, умеренная лейкопения с лимфцитопенией, умеренная тромбоцитопения и моноцитоз. По мере увеличения суммарной дозы качественно менялись клеточные элементы крови и костного мозга с появлением гигантских и уродливых форм клеток. Резко тормозился сперматогенез (1). У погибших обезьян обнаруживалась умеренная гипоплазия лимфоидных органов, очаговая гипоплазия костного мозга, появление в паренхиматозных органах очагов экстрамедуллярного кроветворения. Процесс зависел от исходного состояния животного, протекал с существенными индивидуальными вариациями и носил волнообразный характер с периодами ухудшения и улучшения показателей кроветворения. Обнаруживались видовые различия: в отличие от макаков, у павианов заболевания дизентерией не учащалось, но развивался остеопороз, особенно позвонков, костей черепа и таза, что приводило к резким деформациям скелета. Воспаление носило обычный характер. При отсутствии инфекции обезьяны переносили облучение в суммарных дозах 23 – 36 Зв (2, 9). Выживание в значительной степени зависело от наслоения на лучевой процесс контагиозных и не контагиозных инфекций, основные проявления которых не менялись. (Таблица 1). Таблица 1. Смертность обезьян от спонтанных инфекций. Разо-вая доза в Зв. Смертность/ всего обезьян Контагиозные заболевания Не контагиозные заболевания Дизентерия Сальмонеллез ТБЦ Корь ГЛО Пнев-мония Тонзиллит Сеп-сис Инфекция не установлена 0.16-0,26 . 36/47 (76,6%) 23 (64%) 2 (6%) 2 (5%) 0 0 4 (11%) 0 1 (3%) 4 (11%) 0,057 9/9 (100%) 5 (56%) 0 0 0 0 2 (22%) 1 (11%) 0 1 (11%) 0,043-0,049 26/55 (47%) 11 (42%) 2 (8%) 0 10 (39%) 1 (4%) 1 (4%) 1 (4%) 0 0 0,008-0,014 25/37 (68%) 14 (56%) 3 (12%) 1 (4%) 0 0 1 (4%) 0 1 (4%) 5 (20%) Всего 96/148 (64,8%) 53/96 (52%) 7/96 (7,3%) 3/96 (3%) 10/96 (10%) 1/96 (1%) 8/96 (8%) 2/96 (2%) 2/96 (2%) 10/96 (10%) При ежедневном фракционном облучении 5-ти макаков резусов и 4-х павианов гамадрилов в дозах 0,052–0,057 Зв (мощность дозы 1,9р/ мин.), лучевая патология постепенно приобретала характер процесса, нами обозначенного как хроническая лучевая болезнь. Первые её признаки появились спустя 7 месяцев от начала опыта при суммарных дозах 6–6,5 Зв, что проявлялось в нарушении общего состояния и снижении массы тела. Нарушения кроветворения длительное время были умеренными. Скорость прогрессии болезни зависела от физического состояния животного до начала эксперимента. По достижении суммарной дозы 7,5–8 Зв развивались нарастающая лейкопения, тромбоцитопения, геморрагический диатез (ГД) в виде мелких кровоизлияний в коже и слизистых оболочках. Нарастало снижение массы тела. Течение болезни носило волнообразный характер с периодическими ухудшениями и улучшениями кроветворения на фоне продолжающегося облучения. Гибель обезьян (семи из 9-ти) наступала при получении суммарных доз 7,95–20,60 Зв через 7–14 месяцев от начала облучения при явлениях резкого опустошения костного мозга, лимфоидной ткани и ткани семенников. У трёх макаков резусов – хронических бактерионосителей шигелл, колит носил катаральный характер. Две макаки заболели острой дизентерией на фоне глубокой лейкопении и погибли на 3 и 7 дни заболевания от некротического колита с резко выраженным сосудистым компонентом (геморрагическое пропитывание тканей, выпадение фибрина, резкая гиперемия, развитие стазов и тромбоза сосудов, распространённый отёк тканей). Павианы дизентерией не болели. Два павиана, суммарно облученные в дозе 28 Зв, погибли через 3 месяца и 2 года после прекращения облучения от инфекции и от лейкоза, соответственно. Ежедневное облучение обезьян в дозах 0,16–0, 26 Зв (мощность дозы 1,9р/ми.), проведенное на 37 макаках резусах и 10 павианах гамадрилах, вызывало тяжелую лучевую болезнь, сходную с (ОЛБ), возникающей после массивного однократного тотального облучения, но растянутого во времени. На уровне суммарной дозы 1,2–1,60 Зв общее состояние не страдало, но определялись гематологические нарушения в виде умеренной лейкопении и моноцитоза, а также абсолютной и относительной нейтропении и, особенно, лимфоцитопении, при сохранении нормального уровня показателей красного ростка. На уровне суммарной дозы 2,6–3,6 Зв становились заметными нарушения общего состояния, нарастала лейкопения, появлялись признаки нарушения красного и тромбоцитарного ростков кроветворения. По мере увеличения суммарной дозы развивалась крайняя степень панцитопении и умеренный ГД. Около 50-го дня облучения (суммарная доза 7,18–8,94 Зв) погибло 25 обезьян из 37 от истощения кроветворения и инфекции (большей частью дизентерии, реже пневмонии или тонзиллита). Воспаление носило ареактивный некротический характер. Однако выживание отдельных животных наблюдалось даже при получении дозы 10 Зв. Развитие инфекции усугубляло гематологические нарушения (1, 2). Длительное облучение приводило к интенсивному снижению иммунологической реактивности. Угнетение антителообразования имело место уже по получении суммарных доз 5 – 6 Зв (1). Однако, при испытании состояния иммунной системы макаков (на фоне продолжающегося фракционного облучения) при раневых инфекциях - газовой гангрене и столбняке-обнаруживалась её достаточная сохранность. Макаки, иммунизированные сорбированным трианатоксином на уровне суммарных доз 3,5 и 5 Зв (разовая доза 0,052 – 0,057 Зв, мощность дозы 1,9р/мин.), не заболели, выдержав заражение 3-6 DLM живой культурой Cl. perfringens. Не иммунизированные макаки (интактные и облученные), погибли ( 5 из 6-ти) на 2 - 10 дни заболевания, в связи с развитием глубоких некрозов на месте введения живых микробов и интоксикацией, в то время как облученные иммунизированные обезьян не погибали (3).Динамика титров антитоксина в сыворотке крови у облученных и не облученных животных была сходной (Таблица 2). Таблица 2. Количество антитоксина (в АЕ) в крови иммунизированных обезьян до и после заражения живой культурой Cl. perfringens Суммар-ная доза (в Зв.) Количество обезьян Тяжесть болезни Количество анатоксина в АЕ до и после заражения по дням До заражения 7 дн. 14 дн. 21 день 28 дн. 38 дн. 55 дн. 65 дн. 90 дн. 5,19 4 Легкая и средней тяжести 1,13 6,25 9,75 6,25 2,25 1 0,38 0,2 0,25 6 5 Легкая, средней тяжести, тяжелая 0,9 3,9 14,4 5,5 3,3 1,15 0,52 0,32 0,24 Необлученный контроль 3 Легкая, средней тяжести, тяжелая 1,5 2,8 6,0 3,0 1,17 0,8 0,33 0,2 0,1 Иммунизация и реиммунизация облученных макаков столбнячным сорбированным анатоксином на уровнях суммарных доз 2,7 и 7 Зв, с последующим парентеральным введением столбнячного токсина в дозе 20 DLM через 14 дней после окончания иммунизации (7-ой день после прекращения облучения) предохраняло животных от гибели. Контрольные обезьяны от инъекции 1 DLM столбнячного токсина погибали от столбняка спустя 100 часов после инокуляции (4). Титры антитоксина (в АЕ) в крови облученных обезьян практически не отличались от титров у контрольных животных (Таблица 3). Таблица 3. Уровни столбнячного антитоксина (в АЕ) в сыворотке обезьян, иммунизированных на фоне фракционного облучения. Количество обезьян в группах Титры АЕ после иммунизации (суммарная доза 2,7 Зв). Титры АЕ у реиммунизиро-ванных макак (суммарная доза облучения 7 Зв) Титры АЕ после инокуляция токсина на 14 день Через 6 мес. на 14 день через 21 день 9 облученных 13,9 3,4 14,1 18,6 21,4 3 контроль-ных 6,3 2,3 14,7 16,5 21,25 Острая лучевая болезнь (ОЛБ) обезьян. Однократное тотальном облучение обезьян - макаков резусов в минимальной летальной дозе (МЛД - 6,6-7 Зв рентгеновых лучей, 6,2–6,5 Зв гаммКа-излучения при условиях защиты), или в сублетальных дозах (3-4 Зв) вызывало у них острую лучевую болезнь (ОЛБ), которая длилась около 30 дней и состояла из 3-х основных периодов: латентного периода, периода разгара заболевания и восстановительного периода. Выраженная общая ранняя лучевая реакция (РЛР) при действии МЛД (адинамия, атаксия, колебания температуры тела и кровяного давления, лейкоцитоз, гипергликемия, рвота, реже понос) возникала у 90% обезьян в первые 30 – 60 минут после облучения и длилась 24–30 часов. В течение латентного периода (первые 8-9 дней ОЛБ), при удовлетворительном состоянии животного, отмечалось снижение массы и температуры тела, понижение артериального давления. Ранний критический период у обезьян (6–9 дни ОЛБ) в части случаев проявлялся кратковременным поносом и транзиторным появлением в крови микробов кишечной группы. В разгаре заболевания (9-18 дни ОЛБ) резко угнеталось кроветворение до критического уровня (с 5-го дня - лейкопения с лимфцитопенией - максимум на 8-12 сутки; тромбоцитопения и анемия - максимум 15 – 20 сутки), прогрессивно ухудшалось состояние, повышалась температура, развивалась гипергликемия, ускорялось СОЭ. К 12 дню появлялись признаки умеренного ГД (мелкие кровоизлияния в коже, слизистых оболочках). Развивалось резкое опустошение костного мозга и лимфоидных органов. Гибель обезьян от истощения кроветворения достигала максимума к 13–14 суткам ОЛБ. После облучения в сублетальных дозах (порядка 3–4 Зв) симптомы ОЛБ были выражены слабее (8). Постоянно развивались инфекционные осложнения. При групповом содержании и большом количестве бактериовыделителей шигелл, гибель среди подопытных животных часто была связана с развитием геморрагического колита (до 70% в разных наблюдениях). Морфологически дизентерия сохраняла свои основные черты, но не свойственная дизентерии бактериемия, при некротическом характере колита была относительно частой (до 37% случаев). Реже имела место пневмония, еще реже тонзиллит и воспаление слизистых оболочек рта, кожи и подкожной клетчатки в местах травм. Воспалительный процесс (в том числе после облучения в сублетальных дозах) принимал некротический ареактивный характер с выраженным геморрагическим компонентом (9). Восстановление, при благоприятном течении ОЛБ после облучения в МЛД (в условиях защиты), в первую очередь, кроветворения, становилось отчётливым в период 20–30 суток ОЛБ. Хотя основные нарушения ликвидировались в ближайшие месяцы после облучения, отдаленные последствия прослеживались в течение месяцев и даже лет: количество эритроцитов и гемоглобина оставались сниженными и могли появляться признаки мегалобластического кроветворения, особенно при развитии инфекции, восприимчивость к которой оставалась повышенной. Имела место умеренная гипоплазия костного мозга и лимфоидных органов. После кровопускания (на фоне восстановленного кроветворения) продукция эритроцитов и тромбоцитов была сниженной. У самок были случаи стойкой анемии. Кроветворение оставалось дефектным в течение 2–4 лет, но не наблюдалось спустя 4 года после облучения (6). Нарушения репродуктивной функции у самок, перенесших ОЛБ, (стерильность, аборты, мертворождения, рождение ослабленного детеныша), могли затягиваться до 5-ти лет. У самцов облучение в дозе 5-7 Зв вызывало прекращение сперматогенеза в сроки до 6-ти лет после ОЛБ. Изредка имела место обратимость процесса (9). Для проверки факта сохранения основных черт инфекционного процесса на фоне ОЛБ и роли некрозов в исходе инфекции, было проведено сравнительное исследование трёх инфекций: токсикоинфекции Моргана (катаральный энтерит), сальмонеллеза Бреслау (катаральный энтерит с лейкопенией и гиперплазией лимфоидных органов) и дизентерии (развитие некрозов в слизистой оболочке толстого кишечника). Однократное облучение в сублетальной дозе (3 Зв) с заражением (per os 30–35 млрд микробных тел) на 5-ый день ОЛБ, резко утяжеляло течение инфекций, а в местах некрозов развивалось геморрагическое воспаление. Основные проявления инфекций сохранялись (Таблица 4), но при сальмонеллезе усугублялась лейкопения и не возникало гиперплазии лимфоидной ткани (9). Таблица 4. Характер течения инфекций у м. резусов на фоне ОЛБ. Инфекции Не облученные Облученные Выраженность болезни Симптомы Ги-бель Геморраги-ческое воспаление Выражен-ность болезни Симптомы Гибель (сутки) Геморраги-ческое воспаление Токсико-инфекция + Катарральный энтерит 0 0 +++ Энте-рит 2 / 6 (8-12) 0 Сальмонеллез + Катарральный энтерит 0 0 +++ Энте-рит 2 / 5 (10–12) 0 Дизенте-рия + Колит 0 0 +++ Колит 3 / 3 (8–13) +++ Попытка воспроизведения на облученных обезьянах брюшного тифа (свойственного только человеку) успехом не увенчалась (5). Исследование зависимости характера воспалительной реакции от времени её формирования (до или после облучения) было проведено на 10-ти м. резусах – бактерионосителях дизентерии, облученных в дозе 5 Зв при условии исключения возможности реинфицирования (содержание в станках). Макаки перенесли ОЛБ, за время которой у них периодически возникали нетяжелые поносы. Две обезьяны погибли (на 14 и 17 день ОЛБ) в связи с геморрагическими некрозами, возникшими в местах случайных травм кожи. При морфологическом исследовании признаков обострения колита обнаружено не было. В слизистой оболочке толстого кишечника встречались единичные старые язвы с фиброзными краями. В местах повреждения кожи во время ОЛБ, воспаление носило ареактивный некротический характер (9). Действие радиации, не зависимо от формы облучения, увеличивало у обезьян частоту развития опухолей. Среди 92 макак, перенесших ОЛБ, опухоли, преимущественно доброкачественные (полипы шейки и тела матки, фибромиома матки, папиллярные кисты почек, аденомы печени и щитовидной железы), а также 2 случая плоскоклеточного рака, были обнаружены у 9-ти из 14 обезьян, получивших облучение 5 Зв и выше и погибших спустя 2 – 6,5 лет после облучения. В одном случае из 4-х, павиан, облучавшийся фракционно в дозе 0,57 Зв в день (суммарная доза 28 Зв), погиб от лейкоза спустя 2 года после прекращения облучения. (2, 9). Длительная персистенция хромосомных аберраций (преимущественно сбалансированные хромосомные обмены, как маркеры патологических клонов клеток) обнаруживались в клетках костного мозга макаков резусов в сроки от 3-х до 19 лет после облучения. У перенесших ОЛБ нарушения были более выражены, чем у перенесших длительное фракционное облучение (7). Заключение. При фракционном длительном облучении процесс оставался компенсированным в течение месяцев, и даже лет. Чем меньше ежедневная доза и её мощность, тем медленнее развивался процесс и тем большую роль играют индивидуальная и видовая чувствительность обезьян к облучению и возможность периодической компенсации. При ежедневных дозах 0,01-0,04 Зв классическая ЛБ не развивалась, но постоянными были стойкие нарушения кроветворения. При ежедневной дозе порядка 0,06 Зв по достижении высокого уровня суммарной дозы (20-28 Зв) развивалась лучевая болезнь с критическим угнетением кроветворения, сперматогенеза и иммунитета. Воспаление принимало некротический характер. Однако, иммунизация против раневых инфекции (газовая гангрена, столбняк), при получении значительной суммарной дозы (5-7 Зв.), была эффективной. При ежедневной дозе 0,16-0,26 Зв процесс был сходен с растянутой ОЛБ (переносимая суммарная доза в пределах 9 Зв.). Однократное тотальное воздействие ионизирующей радиации из внешнего источника в МЛД (6,6–7 Зв), при условии защиты, приводило к развитию у обезьян ОЛБ, протекавшей в основном в течение одного месяца с максимальной гибелью на 12 - 14 сутки от истощения кроветворения и инфекции. Особенностью ОЛБ обезьян являлась тяжесть общей ранней реакции, слабое проявление раннего критического периода и умеренная выраженность ГД. Воспалительная реакция на развитие некрозов, возникших во время ОЛБ, принимала необратимый ареактивный геморрагический характер. Реакция на инфекцию, сформировавшуюся до лучевого воздействия, на фоне ОЛБ протекала обычно, оставаясь компенсированной. Облучение не приводит к восприимчивости обезьян к инфекции, не свойственной этому виду животных. В восстановительный период все нарушения постепенно нормализовались. Отдаленные последствия (повышенная восприимчивость к инфекции, неустойчивость кроветворения, угнетение репродуктивной функции) имели место спустя годы после перенесенной ОЛБ. Обучение закономерно вызывало у обезьян нарушение регенерации, повреждение генетического аппарата, иммунной системы и учащение развития опухолей. Фракционное облучение в высокой суммарной дозе вызывало менее выраженную патологию, чем однократное облучение в той же дозе радиации. Инфекционные осложнения становились часто ведущими в процессе в целом. Нозологический профиль инфекций и их основные проявления не менялись. Литература. 1. Джикидзе Э. К. Инфекционные осложнения и состояние иммуногенеза у обезьян при длительном облучении. Сб.: Патогенез, клиника и лечение острой лучевой болезни в опытах на обезьянах. Сухуми, 1964, 62-76. 2. Джикидзе Э. К. Влияниие малых доз ионизирующей радиации на инфекцию и иммунитет. Афтореферат диссертации. Сухуми, 1968. 3. Джикидзе Э. К., Аксенова А. С. Предохранительная вакцинация обезьян против газовой гангрены, вызванной Cl. perfringens в условиях хронического облучения. ЖМЭТ, 1963, 1, 132-137. 4. Джикидзе Э. К., Аксенова А. С. Эффективность предохранительной вакцинации против столбняка в эксперименте на обезьянах при длительном облучении в малых дозах. ЖМЭИ 1964, 12, 2, 19-32. 5. Джикидзе Э. К., Стасилевич З. К. Заражение брюшным тифом обезьян, подвергнутых длительному воздействию ионизирующей радиации в малых дозах. Сб.: Вопросы радиобиологии и механизма действия противолучевых средств. Сухуми, 1967, 18 – 22. 6. Диковенко Е. А., Петрова А.С. Реакция обезьян на кровопотерю в отдаленные сроки после облучения. Сб.: Вопросы радиобиологии и механизма действия противолучевых средств. Сухуми,1967, 35 – 40. 7. Косиченко Л. П. , Баркая В. С. Обезьяна как объект для изучения цитогенетических последствий проникающей радиации. Сб.: Проблемы обеспечения обезьянами медико-биологических исследований и принципы использования обезьян в эксперименте. Сухуми, 1983, 63-65. 8. Семенов Л. Ф., Яковлева Л. А. Сравнительная характеристика лучевой болезни у разных видов млекопитающих, включая приматов. Вестник АМН СССР 1965, 11, 50 – 57. 9. Яковлева Л. А. Сравнительное исследование лучевой болезни и её последствий. Ленинград. Медицина, 1966, 258 стр. Imitation on monkeys of radiation pathology, possible at interplanetary flights of man (retrospective analysis) Yakovleva L.A., Dzhikidze E.K. Research Institute of Medical Primatology RAMS In connection with outer space exploration an actual problem of pathology associated with action of ionizing radiation from outer source arises again because beyond the earth magnetosphere protection both galactic space and solar space radiation in relatively low doses constantly exist. In the moment of solar flares radiation becomes high. Radiation process in animals of different species and in humans is subordinated to the general laws because of DNA damage and subsequent suppression of the process of physiological cell proliferation of constantly regenerating tissues. Monkeys and humans are united in the development of radiation pathology and similarity in cytogenetic radiosensibility and nozological profile of infections that often deposit on radiation pathology. Data on radiation pathology developing after total fractional low dose irradiation and after single massive X-ray or gamma-ray irradiation from outer source were obtained on 332 monkeys (M.mulatta and P. hamadryas) of Sukhumi monkey colony in the 60th of the last century. The forms of radiation influence tested by us on monkeys caused damage of genetic apparatus and also of physiologic hemopoietic and reproductive organs regeneration, of immune system and acceleration of tumor appearance. Infection complications often became leading in the disease outcome. Nosological profile of infections and their main manifestations did not change. At a fractional long lasting irradiation of monkeys the process remained compensated for a long time. The lower was the daily dose and its power, the slower the process developed and the bigger was individual and specific sensitivity and also the possibility of periodic compensations. At long lasting irradiation in relatively low doses (0.01-0.04 Sv daily) extended for the term up to several years classic radiation sickness did not develop. Poorly expressed hemopoietic disorders progressed slowly, susceptibility to infections increased. Tolerable total dose in the absence of infections was 23-36 Sv. At daily doses 0.06 Sv or 0.16-0.26 Sv chronic radiation pathology developed which looked like extended in time acute radiation sickness. At high total doses of radiation hemopoiesis was sharply depressed. Hemopoietic diathesis was moderate. Inflammation was of hemorrhagic nonreactive character. Tolerable total doses in different animals were 9 Sv- 28 Sv and were dependent of joined infection. Preventive immunization against wound infections (gas gangrene, tetanus) in conditions of fractional irradiation (0.06 Sv daily) and total doses of 5-7 Sv was effective. Single irradiation at dose near to minimal lethal (6.6-7 Sv) inevitably causes acute radiation sickness (ARS) that lasted about one month with sharp hemopoiesis depression and maximum deaths of hemopoietic organs exhaustion or infection on the 12th-14th day. Feature of monkey ARS was heavy early reaction, poor early critical period of manifestation and moderate hemorrhagic diathesis expression. Inflammation (of infectious origin) in the case of necrosis development acquired irreversible nonreactive hemorrhagic character. Inflammatory reaction formed before irradiation developed as usual on the ARS background. Restoration period (after the 19th – 20th days of ARS) developed slowly. Remote effect of ARS (increase of infections, instability of hemopoiesis, depression of reproductive function, chromosome disorders, increase of tumor development) occurred during many years after ARS. Fractional irradiation at high total dose produced less expressed pathology than single irradiation at the same dose. Irradiation did not cause susceptibility of monkeys to infection non peculiar to this given species of animals. Imitation of radiation pathology possible during manned interplanetary flights on monkeys. Yakovleva L.A. & Dzhikidze E.K. Space exploration implies very important pathology problem associated with ionizing radiation. It comes from different space sources and low doses irradiation by solar and galactic radiation will take place especially outside the Earth magnetosphere protection. In moments of solar flares the radiation levels become high. Pathologic action of radiation causes DNA damage and subsequent suppression of physiological cell proliferation processes of dividing cells and has common traits in both human and different animal species. Both monkeys and humans have similar cytogenetic radiosensitivity and nozological infection profile, superimposed on radiation pathology. Data on radiation pathology developing after total fractional low dose irradiation and after single massive X-ray or gamma-ray irradiation from outer source were obtained on 332 monkeys (M.mulatta and P.hamadryas) of Sukhumi monkey colony in the 60th of the last century. These radiation forms caused damage of monkey genetic apparatus and broke of physiologic hemopoietic and reproductive organ regeneration, function of immune system and increased of tumor incidence. Infection complication often became leading causes in the disease outcome. Nozological profile of infection and their main manifestation did not change. At a fractional long lasting monkey irradiation the process remained compensated for a long time. The lower the daily dose and power of radiation the slower the process developed and the bigger role plays the individual and specific sensitivities and also the possibility of periodic compensations. At long lasting irradiation in relatively low doses (0.01 – 0.04 Sv daily) extended for period up to several years classic radiation sickness did not developed. Poorly expressed hemopoietic disorders progressed slowly and susceptibility to infection increased. Total tolerable dose in the absence of infection was 23-36 Sv. At daily doses 0.06 Sv or 0.16-0.26 Sv chronic radiation pathology developed which was similar to extended in time acute radiation sickness. At high total doses of radiation hemopoiesis was sharply depressed. Hemopoietic diathesis was moderate. Inflammation has hemorrhagic nonreactive character. Total tolerable doses in different animals were 9 – 28 Sv and were dependent of joined infection. Prophylactic immunization against wound infection (gas gangrene, tetanus) in conditions of fractional irradiation (0.06 Sv daily) and total doses of 5-7 Sv was effective. Single irradiation dose close to minimal lethal (6.6 – 7 Sv) inevitably caused radiation sickness (ARS) lasted about one month with sharp hemopoiesis depression and maximal deaths numbers due to hemopoietic organ exhaustion or infection on the 12th – 14th days. Feature of monkey ARS was severe early reaction, poor early critical period of manifestation and moderate hemorrhagic diathesis expression. Inflammation (of infection origin) in the case of necrosis developed acquired irreversible nonreactive hemorrhagic character. Inflammatory reaction formed before irradiation developed as usual on the ARS background. Recovering period (after the 19th – 20th day of ARS) developed slowly. Remote ARS consequences (increase of infection, hemopoiesis instability, reproductive function depression, chromosome disorders, and increase of tumor formation numbers) occurred during many years after ARS. Fractional high dose irradiation produced less expressed pathology than the dose single irradiation. Irradiation did not cause susceptibility of monkeys to infection non peculiar for this given animal species. СТЕНДОВЫЕ ДОКЛАДЫ ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДНОГО ПРЕПАРАТА ЭПИТАЛОНА НА ЭНДОКРИННУЮ ФУНКЦИЮ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ САМОК МАКАК РЕЗУСОВ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП Венгерин А. А., Оганян Т. Э., Гончарова Н. Д. НИИ Медицинской Приматологии РАМН, Сочи-Адлер, Россия Исследования в области физиологии и патофизиологии островкового аппарата поджелудочной железы доказывают ведущую роль возрастных нарушений чувствительности периферических тканей к инсулину и ?-клеток поджелудочной железы к глюкозе в развитии инсулиннезависимого сахарного диабета (ИНСД) [1, 7, 4, 5, 6]. Заболеваемость ИНСД в последние годы возрастает и является одной из причин преждевременной инвалидности и смертности лиц пожилого и старческого возраста. Однако, до сих пор остаются не изученными факторы, определяющие чувствительность периферических тканей к инсулину и ?-клеток островков Лангерганса к глюкозе. Не разработаны также эффективные и безопасные средства их нормализации при старении. Анализ литературных данных по существующим в настоящее время подходам к коррекции возрастных нарушений гормональной функции островкового аппарата поджелудочной железы заставил обратить наше внимание на физиологически активный препарат эпифиза – эпиталон [3, 8]. Целью работы явилось изучение характера изменений функции островкового аппарата ?-клеток поджелудочной железы в процессе старения у лабораторных приматов и оценка возможности использования пептидных препаратов эпифиза эпиталона для коррекции возрастных нарушений гормональной функции островкового аппарата ?-клеток поджелудочной железы. Методика исследования Объектом исследования явились 42 клинически здоровых самок макак резусов (Macaca mulatta) в возрасте 6 – 27 лет массой тела 4 – 6 кг, содержащихся в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН (г. Сочи-Адлер). В зависимости от возраста животные были распределены в две группы. Первую группу составили 21 животное в возрасте 6 – 8 лет (молодые половозрелые), 2-ю – 21животное в возрасте 20 - 27 лет (старые животные). Эксперимент проходил в летне-осеннее время с июня по сентябрь, в этот период времени, как правило, для самок макак резусов не характерно наличие половых циклов. Для изучения возрастных изменений гормональной функции поджелудочной железы и влияния тетрапептида эпиталона - Ala-Glu-Asp-Gly, синтезированного в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (дир. - акад. РАМН, проф. В. Х. Хавинсон) на функцию островкового аппарата поджелудочной железы после 4-х недельного адаптационного периода к процедуре взятия крови были проведены 2 эксперимента. В одном эксперименте проводилась оценка возрастных изменений гормональной функции поджелудочной железы. С этой целью было использовано 28 животных (14 молодых и 14 старых). В другом эксперименте для изучения влияния эпиталона на гормональную функцию поджелудочной железы использовали 7 молодых и 7 старых обезьян. Всем животным в обоих экспериментах проводили глюкозотолерантный тест. Причем для изучения влияния эпиталона глюкозотолерантный тест проводили 4 раза: до введения эпиталона (за 1мес до введения), на 9-й день введения, а также через 1 мес и 2 мес после его отмены. Для проведения глюкозотолерантного теста всем животным натощак в 9.00 – 9.30 ч утра внутривенно вводили 40% раствор глюкозы из расчета 300 мг/кг м. т. Взятие образцов крови проводили до введения глюкозы (0) и через 5, 15, 30, 60 и 90 мин после ее введения. Через 2 недели после взятия образцов крови для оценки базального уровня глюкозы, 4м молодым и 4м старым животным в течение 10 последовательных дней вводили эпиталон (в дозе 10 мкг/животное в 1 сутки внутримышечно), а контрольным животным (3 молодым и 3 старым) - плацебо (0,9% раствор хлористого натрия в воде). Взятие всех образцов крови проводили из локтевой или бедренной вены с использованием гепарина или ЭДТА в качестве антикоагулянтов. Кровь, немедленно после взятия, центрифугировали при 2000g и +40С. Концентрацию глюкозы в плазме крови сразу же после центрифугирования определяли глюкозооксидантным методом. При оценке результатов глюкозотолерантного теста рассчитывали площадь изменения концентрации глюкозы в плазме периферической крови в течение 90 мин. в ответ на введение стандартной дозы глюкозы (300 мг/кг м. т., внутривенно) – площадь ответа в (ммоль/л)?мин. Расчет площади ответа проводили по формуле трапеции [2]. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили общепринятыми статистическими методами с использованием t-критерия Стьюдента, корреляционного и регрессионного анализа. Результаты исследования Динамика концентрации глюкозы в плазме крови в ответ на введение стандартной дозы глюкозы представлена на рис. 1. Существенные возрастные различия наблюдались в концентрации глюкозы через 5, 15, 30 и 60 мин после введения глюкозы. У старых животных в эти промежутки времени концентрация глюкозы была значимо выше по сравнению с молодыми животными. Рис. 1 Динамика концентраций глюкозы в плазме периферической крови в ответ на введение стандартной дозы глюкозы (300 мг/кг м. т., в/в) у самок макак резусов разного возраста (1 – 6-8 лет; 2 – 20-27 лет). Примечание: *Р<0,05, *** Р<0,001 - по отношению к соответствующим значениям у молодых животных. Площадь под кривой ответа уровня глюкозы на введение стандартной дозы глюкозы, у старых животных в базальных условиях была достоверно выше по сравнению с молодыми животными (соответственно 479,6±38,0 ммоль/л?мин против 294,9±9,3 ммоль/л?мин у молодых животных, Р < 0,001, табл. 1). В ответ на введение эпиталона у старых животных наблюдалась тенденция к снижению базального уровня глюкозы (3,8±0,4 ммоль/л против 4,0±0,4 ммоль/л до введения препарата) и изменение динамики уровня глюкозы в ответ на введение стандартной дозы глюкозы (табл. 1). Таблица 1 Динамика уровня глюкозы и площадь под кривой ответа концентрации глюкозы в плазме периферической крови на введение стандартной дозы глюкозы (300 мг/кг м. т., внутривенно) у самок макак резусов разных возрастных групп до введения эпиталона, на 9-й день введения эпиталона и через 1 и 2 месяца после его отмены (M+m) Возрастные группы животных Время после введения глюкозы, мин Площадь ответа, ммоль/л?мин 0 5 15 30 60 90 Концентрация глюкозы, ммоль/л До введения эпиталона 6 – 8 лет 3,8±0,1 9,2±0,4 5,6±0,2 3,9±0,4 3,4±0,1 3,5±0,2 294,9±9,3 20 – 27 лет 4,0±0,4 12,0±0,5 P<0,05 9,8±0,6 P<0,001 7,8±0,9 P<0,001 5,0±0,4 P<0,001 4,1±0,5 479,6±38,0 P<0,001 На фоне введения эпиталона 6 – 8 лет 3,6±0,3 8,9±0,7 6,1±0,6 3,9±0,6 3,8±0,3 3,7±0,5 343,3±48,2 20 – 27 лет 3,8±0,4 8,4±0,6 P1<0,001 6,8±0,8 P1<0,01 5,7±0,9 3,9±0,4 P1<0,05 3,1±0,2 388,9±43,6 Через 1 месяц после отмены эпиталона 6 – 8 лет 3,8±0,2 8,2±0,3 7,2±0,6 4,9±0,5 3,4±0,1 4,1±0,1 353,0±19,9 20 – 27 лет 4,1±0,3 9,5±0,7 P1<0,001 8,4±0,8 7,7±0,6 P<0,01 5,2±0,5 P<0,01 4,5±0,7 480,0±55,0 P<0,05 Через 2 месяца после отмены эпиталона 6 – 8 лет 3,7±0,3 8,4±1,1 5,9±0,5 4,1±0,56 3,2±0,17 3,1±0,1 293,2±25,0 20 – 27 лет 4,2±0,4 8,6±0,7 P1<0,05 8,1±0,6 P<0,01 P1<0,05 7,4±1,0 P<0,01 5,3±0,9 P<0,05 4,1±0,6 451,0±46,0 P<0,01 Примечание: P – по отношению к соответствующим значениям у молодых животных; Р1 - по отношению к соответствующим значениям до введения эпиталона. Как видно из таблицы 1, концентрация глюкозы у старых животных статистически значимо снижалась через 5, 15 и 60 мин в ответ на инъекцию глюкозы на фоне введения эпиталона. В то же время базальный уровень и динамика концентрации глюкозы в ответ на инъекцию глюкозы на фоне введения эпиталона у молодых животных не претерпевали существенных изменений (табл.1). Через 1 и 2 месяца после отмены эпиталона базальные уровни глюкозы, значения глюкозы в различные интервалы времени после введения стандартной дозы глюкозы (через 30, 60, 90 мин) и площади ответа глюкозы возвращались к исходным значениям (табл.1). В то же время значения концентрации глюкозы через 5 и 15 мин еще оставались пониженными по сравнению с исходным уровнем (табл. 1). Таким образом, представленные данные указывают, что при старении у самок макак резусов развиваются выраженные нарушения в эндокринной функции поджелудочной железы, такие как, повышение базальных уровней глюкозы и чувствительность ?-клеток островкового аппарата к глюкозе. (Таб. 1) Десятидневный курс эпиталона в дозе 10 мкг/животное в 1 сутки внутримышечно приводит к восстановлению нарушающейся при старении толерантности к глюкозе. Повышение толерантности к глюкозе частично сохраняется через 1 мес и даже 2 мес после отмены препарата. Восстанавливающее действие эпиталона на функцию островкового аппарата поджелудочной железы и метаболизм глюкозы, по-видимому, связано с восстановлением чувствительности ?-клеток к уровню глюкозы в крови (Таб. 1). Список литературы 1. Аметов А. С. Инсулиносекреция и инсулинорезистентность: две стороны одной медали // Проблемы эндокринологии – 2002. – Т. 48, № 3. – Р. 31 – 37. 2. Выгодский М. Я. Справочник по высшей математике // Москва – 1962. – С. 480 3. Кузник Б. И. Цитомедины: 25 - летний опыт экспериментальных и клинических исследований / Б. И. Кузник В. Г. Морозов, В. Х. Хавинсон // СПб.: Наука. - 1998. – С. 310. 4. Barbieri M. Glucose regulatuion and oxidative stress in helthy centenarians / M. R. Rizzo, D. Manzella, et al. // J. Experimental Gerontology - 2002. - Vol. 38, N. 1-2 - P. 137-143. 5. Bellino F.L. Nonhuman primaie models of menopause workshop / F.L.Bellino P.M.Wise // Biol. Reprod. - 2003. – Vol. 68, - P. 10-18. 6. Berstein L. M. Modern concepts of hormonal carcinogenesis: mechanisms, predisposing factors, consequences // Hormones, age and cancer Edited by L. Berstein St. Petersburg «NAUKA» - 2005. 256 p. 7. Kahn S. E. The pathophysiology of type II (non-insulin-dependent) diabetes mellitus: implications for treatment / S. E. Kahn, D. Jr. Porte // In Ellenberg and Rifkin’s Diabetes Mellitus Rifkin H. Porte D. Jr. Eds. New York, Elsevier – 1990. – P. 436-456. 8. Khavinson V. Kh. Peptides and Ageing // Neuroendocrinology Letters. – 2002. – Vol. 23 (Suppl. 3). P. 144. THE EFFECT OF A PEPTIDE EPITALON ON THE ENDOCRINE FUNCTION OF PANCREAS IN RHESUS MONKEYS OF DIFFERENT AGE GROUPS Vengerin A.A., Oganyan T.E., Goncharova N.D. Research Institute of Medical Primatology, Sochi-Adler, Russia. The results of the investigations on physiology and pathophysiology of pancreatic insular apparatus confirm a leading role of age-related changes in the sensitivity of peripheral tissues to the insulin and the reaction of pancreatic ?-cells to glucose in the development of insulin-independent diabetes (IUD) [1,7,4,5,6]. The analysis of recent data on the methods of corrections in age-related disorders of hormonal function of pancreatic insular apparatus stimulated us to pay attention at a physiologically active epiphysis drug – the epitalon [3, 8]. In this report the results of investigations on age-related changes in hormonal functions of pancreatic insular apparatus and on the possible correcting effect of epitalon on the function of pancreatic insular apparatus in the experiments on monkeys are presented The results. The dynamics of glucose concentration in blood plasma in response to standard dose glucose administration is shown in fig.1. Significant age-related differences in glucose concentration were noted 5,15, 30 and 60 min later after glucose administration. Glucose concentrations in old animals at these time points were significantly higher comparing to those in young animals. The area under the curve of glucose level response after the administration of standard dose in basal conditions was significantly larger comparing to young animals (479.6+ 38.0 ?mol/l/min vs. 249/9+9.3 ?mol /min in young animals P< 0.001, respectively, Table 1) After epitalon administration the old animals showed the tendency to lowering the basal glucose levels (3.8+0.4 ?mol/l vs. 4.0+0.4 ?mol/l before the the drug administration) and the change of the dynamics in glucose levels after the administration of a standard dose (Table 1). Table 1 shows that concentration of glucose in old animals was significantly lower 5, 15 and 60 min later after glucose infusion against the background of epitalon administration. At the same time, no significant changes have been noted in young animals in basal levels and in the dynamics of glucose concentration in response to glucose injection against the background of epitalon administration (Table 1). One or two months later after the withdrawal of epitalon administration the basal glucose levels in different intervals after standard dose administration (30,60,90 min. later) and the area under the curve of glucose response were recovered attaining the initial values (Table 1). At the same time the values of glucose concentration 5 and 15 min later were still lower comparing to the initial levels (Table 1). Thus, ten day course of epitalon administration results in the recovery of tolerance to glucose that impairs with aging. The increase of tolerance to glucose partly retains one and even two months later after the withdrawal of the drug. The regenerative effect of epitalon on the function of pancreatic insular apparatus and on the glucose metabolism is probably associated with the recovery of ?-cell sensitivity to blood glucose levels. АКТИВНОСТЬ ЭРИТРОЦИТАРНОЙ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У САМОК МАКАК РЕЗУС РАЗНОГО ВОЗРАСТА С РАЗНЫМ ТИПОМ ПОВЕДЕНИЯ Маренин В.Ю., Гончарова Н.Д., Шмалий А.В., Венгерин А.А. НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия В литературе имеется достаточное количество работ, посвящённых функционированию различных систем организма как в базальных условиях, так и в условиях стресса. Однако практически все эти работы были выполнены без учёта особенностей индивидуального поведения объекта исследования. В то же время в ряде наших предыдущих работ [1, 2, 5, 16] было показано, что использование усреднённых по характеру адаптивного поведения показателей для оценки функционирования гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) в базальных условиях и в условиях психоэмоционального стресса должно применяться с осторожностью, поскольку не может дать полной картины возрастных изменений, несмотря на их общую направленность, т.к. эти показатели у животных с разным типом адаптивного поведения различны. Кроме прочего, в литературе, за исключением нашего исследования, полностью отсутствуют сведения о характере индивидуальных особенностей функционирования антиоксидантной ферментной системы (АОФС) эритроцитов в базальных условиях и в условиях психоэмоционального стрессового воздействия. Ранее нами было показано [3, 5, 15, 18], что в условиях стрессовых воздействий и в процессе старения наибольшим изменениям подвергается активность эритроцитарных глутатионредуктазы (ГР) и супероксиддисмутазы. Поэтому особый интерес представляло изучение зависимости активности эритроцитарной ГР от принадлежности животных к той или иной поведенческой группе в разные возрастные периоды, поскольку в доступной литературе таковые сведения отсутствуют. Поэтому целью данной работы явилось изучение возрастных и индивидуальных различий уровня активности эритроцитарной ГР в базальных условиях и в условиях психоэмоционального стресса в эксперименте на лабораторных приматах – самках макак резус (Macaca mulatta). Обезьяны этого вида являются адекватной и наиболее близкой к человеку моделью, доступной для исследований в данной области, что позволяет экстраполировать полученные результаты на человека. Экспериментальное исследование было выполнено на базе лаборатории эндокринологии НИИ МП РАМН, г. Сочи. В экспериментах было использовано 23 здоровых молодых половозрелых (6-8 лет) и 23 старых (20-27 лет) самок макак резус, содержащихся в питомнике НИИ МП РАМН. Животные обычно содержались в вольерах либо в клетках для группового содержания, а на время экспериментов были отсажены в индивидуальные метаболические клетки в изолированное помещение с контролируемыми температурой (20-25?С) и световым режимом (свет с 06.00 ч до 18.00 ч). Эксперименты проводились в летне-осенний период (июнь-сентябрь), когда овариально-менструальные циклы у самок данного вида обезьян обычно отсутствуют. Состояние здоровья животных контролировалось неинвазивными методами (по подвижности животного, состоянию волосяного покрова, стула, мочи, микробиологическим показателям ректальных мазков, цвету и степени набухания «половой кожи»), а также по общему и биохимическому анализу крови. Животные получали привычное для них сбалансированное питание в виде гранулированного корма, изготавливаемого по технологии фирмы «Altromin» (Германия), дополнительно хлеб, вареное яйцо, свежие овощи и фрукты, а также воду в неограниченном количестве. В течение четырёх недель животные подвергались адаптации к пребыванию в метаболических клетках и процедуре взятия образцов крови. Поведение животных оценивалось как в адаптационный период, так и собственно экспериментальный. Оценка поведения проводилась с учётом ранее опубликованных рекомендаций для лабораторных приматов [6, 7, 10, 13]. В зависимости от особенностей адаптивного поведения обезьяны были распределены в три типологических группы: I группа – животные с активным, агрессивным типом поведения, II группа – со средним (стандартным) типом поведения и III группа – с преимущественно пассивным, депрессивно-подобным поведением. В I группу вошло 5 молодых и 5 старых животных, во II группу – 9 молодых и 9 старых животных, в III группу – 9 молодых и 9 старых животных. В ходе эксперимента у животных производилась венопункция в 09.00 ч. для определения базального уровня активности ГР. Также животные в 15.00  ч подвергались острому умеренному психоэмоциональному стрессовому воздействию – ограничению подвижности (иммобилизации) в течение 2 ч. Ограничение подвижности достигалось путем перемещения подвижной задней стенки метаболической клетки в сторону неподвижной передней стенки и прижатия животного к последней. Тело животного и конечности при этом не были жёстко фиксированы. Взятие образцов крови проводили до начала стрессового воздействия (0 мин) и через 30, 60, 120 и 240 мин после начала иммобилизации. Все образцы крови (2,5-3,0 мл) были взяты из локтевой либо из бедренной вены животных натощак с иcпользованием гепарина в качестве антикоагулянта и немедленно центрифугировались при 2000 g и температуре +4?С. Эритроцитарную массу отделяли от плазмы и хранили до проведения анализов при -70?С. Активность ГР (EC 1.6.4.2) в гемолизате эритроцитарной массы измерялась кинетическим спектрофотометрическим методом и выражалась в нмоль НАДФН за 1 мин на 1 мг общего белка эритроцитов. Уровень общего белка определялся по методу Лоури. Результаты исследования активности ГР в эритроцитах периферической крови у молодых и старых самок макак резус в базальных условиях в 09.00 ч. позволили установить (рис. 1) отсутствие значимых различий в уровне активности этого фермента у молодых животных с разным типом адаптивного поведения. При этом было обнаружено, что при старении активность ГР достоверно увеличивается только в группе животных с депрессивноподобным типом поведения. Рис. 1. Активность ГР в эритроцитах крови у самок макак резус разного возраста с разным типом поведения в 09.00 ч (М±m) * p<0,05 – отличия от старых животных со стандартным типом поведения; # p<0,05 – возрастные различия Обезьяны со стандартным типом поведения вне зависимости от возраста характеризовались наименьшей активностью эритроцитарной ГР. У этой группы обезьян не было обнаружено даже тенденции к увеличению активности ГР с возрастом (рис. 1). Увеличение активности эритроцитарной ГР в процессе старения отмечалось также в ряде клинических и экспериментальных исследований [8, 9, 14, 17]. Однако в этих работах не проводился анализ зависимости возрастных изменений активности ГР от типологических особенностей индивидов. В литературе имеются сведения о том, что в ответ на острое стрессовое воздействие (иммобилизационный стресс, нанесённый в 15.00 ч.) у молодых животных регистрируется существенно более выраженное увеличение активности эритроцитарной ГР по сравнению со старыми животными [4, 8, 14, 18]. При этом изменения активности эритроцитарной ГР тесно коррелируют с изменениями активности ГГАС. Однако в литературе крайне мало сведений о характере стресс-реактивности ГР у животных с различным типом индивидуального поведения [5]. При оценке характера изменений активности эритроцитарной ГР в ответ на стандартизированное острое стрессовое воздействие (двухчасовую нежёсткую иммобилизацию в метаболических клетках) в 15.00 ч было выявлено, что исходный уровень активности ГР (0 мин) различался у животных с разным типом поведения. У молодых животных с депрессивноподобным поведением базальная активность ГР была выше, чем у молодых животных со стандартным типом поведения (0,525±0,069 нмоль НАДФН/мин/мг белка против 0,318±0,058 нмоль НАДФН/мин/мг белка соответственно, p<0,05). В ответ на иммобилизационный стресс у молодых животных со стандартным типом поведения увеличение активности эритроцитарной ГР было существенно выше по сравнению со старыми животными (рис. 2а). Рис. 2. Динамика изменения активности эритроцитарной глутатионредуктазы у самок макак резусов разного возраста с разным типом поведения в ответ на острое стрессовое воздействие в 15.00 ч (М±m, % от исходного уровня) * p<0,05 – возрастные различия В то же время не наблюдалось значимых возрастных изменений в величине подъёма активности ГР у животных с депрессивноподобным типом поведения (рис. 2б). Это происходило, возможно, вследствие того, что наблюдались различия в исходной (базальной) активности ГР у молодых животных. Выявленные возрастные различия в реакции эритроцитарной ГР на острое стрессовое воздействие у животных со стандартным типом поведения хорошо согласуются с результатами исследований, ранее выполненных в лаборатории эндокринологии НИИ МП РАМН и не учитывающих особенности индивидуального поведения животных [8, 14, 17, 18]. Кроме того, они согласуются с возрастными различиями в реакции ГГАС у животных с таким же типом поведения. Последнее обстоятельство дает основание считать, что реакция эритроцитарной ГР на мягкое острое стрессовое воздействие зависит от стресс-реактивности кортизола и что ГГАС играет важную роль в регуляции активности эритроцитарной ГР, надёжность которой снижается при старении. Учитывая литературные данные о том, что повышение активности ГР в различных тканях в условиях мягкого стресса выполняет адаптивную функцию, способствуя увеличению уровня восстановленного глутатиона, поддерживающего редокс-потенциал эритроцитов [11, 12, 19], можно полагать, что адаптивная способность эритроцитов к стрессу у животных с депрессивноподобным поведением нарушается в процессе старения в большей степени, чем у животных остальных типологических групп. Это говорит, в свою очередь, о наименьшей устойчивости животных с таким типом поведения к стрессогенным воздействиям окружающей среды, а также к возрастным нарушениям. Литература 1. Гончарова Н.Д., Маренин В.Ю. Возрастные изменения функции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы у индивидов с различным типом адаптивного поведения // Успехи геронтол. – 2009. – Т. 22, № 4. – С. 605-612. 2. Гончарова Н.Д, Маренин В.Ю., Лапин Б.А. и др. Способ прогнозирования депрессивного поведения старого примата, темпов его старения и развития возрастной патологии // Решение о выдачи патента на изобретение от 15.06.2009. Регистрационный номер: 2008 102 625/002 861. 3. Гончарова Н.Д., Маренин В.Ю., Оганян Т.Э. и др. Стресс, старение, гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и надёжность антиоксидантной ферментной защиты // Успехи геронтол. – 2008. – Т. 21, № 4. – С. 548-554. 4. Гончарова Н.Д., Шмалий А.В., Маренин В.Ю., Смелкова С.А. Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и ферменты глутатионзависимой антиоксидантной системы при стрессе и старении // Бюл. экспер. биол. мед. – 2007. – № 11. – С. 482-487. 5. Маренин В.Ю. Возрастные и индивидуальные особенности реакции гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы и антиоксидантной ферментной системы эритроцитов на психоэмоциональное стрессовое воздействие у обезьян // Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.13 – Сочи, 2009. – 26 с. 6. Чирков А.М., Цулая М.Г., Чиркова С.К. и др. Психофармакология эмоционального стресса у обезьян. – Тбилиси: Мецниереба. – 1989. – 509 с. 7. Чирков А.М., Чиркова С.К., Старцев В.Г. Эмоциональный стресс у обезьян. – Л.: Наука, 1987. – 164 с. 8. Шмалий А.В. Взаимосвязь возрастных изменений функции коры надпочечников и пинеальной железы и надежности антиоксидантной ферментной защиты у самок макак резусов // Автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.53. – СПб., 2007. – 26 с. 9. Andersen H.R., Jeune B., Nybo H., et al. Low activity of superoxide dismutase and high activity of glutathione reductase in erythrocytes from centenarians // Age Ageing. – 1998. – Vol. 27, № 5. – P. 643-648. 10. Arborelius L., Owens M.J., Plotsky P.M., Nemeroff C.B. The role of corticotropin-releasing factor in depression and anxiety disorders // J. Endocrinol. – 1999. – Vol. 160, № 1. – P. 1-12. 11. Arthur P.G., Lim S.C.C., Meloni B.P. et al. The protective effect of hypoxic preconditioning on cortical neuronal cultures is associated with increases in the activity of several antioxidant enzymes // Brain Res. – 2004. – Vol. 1017. – P. 146-154. 12. Baek S.H., Min J.N., Park E.M. et al. Role of small heat shock protein hsp25 in radioresistance and glutathione-redox cycle // J. Cell Physiol. – 2000. – Vol. 183. – P. 100-107. 13. Butter Ch.M., Snyder D.R. Alterations in aversive and aggressive behaviors following orbital frontal lesions in rhesus monkeys // Acta Neurobiol. Exp. – 1972. – Vol. 32. – P. 525-565. 14. Goncharova N.D. Hypothalamic-pituitary-adrenal axis and antioxidant enzymes: Circadian rhythms, stress, and aging // Frontiers in Neuroendocrinol. – 2006. – Vol. 27. – P. 52-53. 15. Goncharova N.D., Marenin V.Yu., Bogatyrenko T.N. Stress, aging and reliability of antioxidant enzyme defense // Current Aging Science. – 2008. – Vol. 1, № 1. – P. 22-29. 16. Goncharova N.D., Marenin V.Y., Oganyan T.E. Aging of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis in nonhuman primates with depression-like and aggressive behavior // Aging. – 2010. – Vol. 2, № 11. – P. 854-866. 17. Goncharova N.D., Shmaliy A.V., Bogatyrenko T.N., Koltover V.K. Correlation between activity of antioxidant enzymes and circadian rhythms of corticosteroids in Macaca mulatta monkeys of different age // Exp. Gerontol. – 2006. – Vol. 41. – P. 778-783. 18. Goncharova N.D., Shmaliy A.V., Marenin V.Y. et al. Circadian and age-related changes in stress responsiveness of the adrenal cortex and erythrocyte antioxidant enzymes in female rhesus monkeys // J. Med. Primatol. – 2008. – Vol. 37, № 5. – P. 229-238. 19. Preville X., Salvemini F., Giraud S. et al. Mammalian stress proteins protect against oxidative stress through their ability to increase glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and by maintaining optimal cellular detoxifying machinery // Exp. Cell. Res. – 1999. – Vol. 247. – P. 61-78. ACTIVITY OF GLUTATHIONE REDUCTASE IN BLOOD ERYTHROCYTES OF YOUNG AND OLD FEMALE RHESUS MONKEYS WITH VARIOUS TYPES OF ADAPTIVE BEHAVIOR Marenin V.Yu., Goncharova N.D., Shmaliy A.V., Vengerin A.A. Research Institute of Medical Primatology of the Russian Academy of Medical Sciences, Sochi, Russia. There are no data on the age-related changes in the glutathione dependent antioxidant system (GAS) in individuals with different types of adaptive behavior. Therefore, we have investigated aging of the GAS of erythrocytes in female rhesus monkeys that differ in adaptive behavior. Twenty-three young adult (6-8 years) and twenty-three old (20-27 years) healthy female rhesus monkeys (Macaca mulatta) were used in the experiments. Glutathione reductase (GR) activity in blood erythrocytes under basal conditions (at 0900) and under acute psycho-emotional stress (at 1500) was measured in blood erythrocytes of young and old female rhesus monkeys with various types of adaptive behavior (aggressive, standard, and depression-like). We evaluated the behavior of monkeys housed individually, in metabolic cages. Classification of behavior was done according to recommendations for laboratory primates. Depending on behavioral features, both young and old animals were divided into three groups. The first group comprised animals with active, aggressive type of behavior (5 young and 5 old animals), the second group consisted of the animals with active behavior, lacking strong features of aggression or depression (in other words standard behavior) (9 young and 9 old animals), and the third group included animals mainly with passive, depression-like behavior (9 young and 9 old animals). Animals of all age and behavioral groups underwent an acute psycho-emotional stress: moderate restraint in a metabolic cage for two hours. Under basal conditions, at 0900 hours, there were no significant inter-group differences in GR activity in young animals. With aging, basal GR activity significantly increased only in group with depression-like behavior and at the same time became significantly higher in comparison with old animals with standard behavior. Monkeys with standard type of behavior, regardless of age, were characterized by the lowest basal GR activity. In response to acute psycho-emotional stress increase of GR activity in young animals with standard behavior was significantly higher (120 minutes after initiation of immobilization) in comparison with old animals with this type of behavior. At the same time, no significant age-related changes in GR activity elevation were revealed for animals with depression-like behavior. Age-related differences in GR stress reactivity are similar to the results from our previous studies in which stress reactivity of cortisol in monkeys with various types of adaptive behavior was investigated. Besides, the data obtained also show the smallest resistance of animals with depression-like behavior to stresses, as well as to the aging disturbances. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ ПАВИАНОВ ГАМАДРИЛОВ И МАКАК РЕЗУСОВ СУХУМСКОГО ПИТОМНИКА В СРАВНИТЕЛЬНО-ВОЗРАСТНОМ АСПЕКТЕ Фоменко В.Н., Хашиг Н.Э., Баркая В.С., Ахуба Л.О., Алексян А.А., Джикирба Р.Р., Сабекия Ж.Д., Джелиев Л.И.. Научно-исследовательский институт Экспериментальной Патологии и Терапии АНА, Сухум,Абхазия У всех млекопитающих, включая обезьян, в процессе эволюционного развития сложилась высоко эффективная система гемостаза, представляющая собой сложный механизм, способный предотвратить кровопотерю и избежать опасности возникновения тромбозов. Нарушение в свертывании крови являются одной из наиболее распространенных причин смерти в мире и поэтому одна из актуальных задач всей медицины – уметь адекватно диагностировать нарушения гемостаза с помощью биохимических методов [ 2, 6 ]. Представленный материал включает обследование биохимических показателей крови у обезьян основного стада Сухумского питомника. Цель работы: оценка состояния здоровья обезьян по биохимическим критериям в настоящее время для дальнейшего использования их в медико-биологических экспериментах. Материалы и методы. Работа выполнена на 2-х видах лабораторных приматов (павианах гамадрилах (35) и макак резусах (62). Обследование проводилось в течение 3-х лет. По общеклиническим данным обезьяны здоровы, содержание их клеточное. По возрастному критерию определены 3 группы: 1 группа – от 5 до 10 лет, 2 группа – от 11 до 19 лет, 3 группа – от 20 лет и старше. Взятие крови проводилось в утренние часы из локтевой вены для исследования системы гемостаза с использованием 3,8% цитрата натрия в качестве антикоагулянта в соотношении 9:1. Далее кровь центрифугировалась в 2-х режимах 1500 и 3000 об/мин в течение 10 и 15 мин при комнатной температуре для получения плазмы. Оценка состояния системы гемостаза велась по 7 основным, наиболее используемым в клинической лаборатории, показателям: аутокоагуляционный тест – АКТ (включает 3 параметра – А, МА, ИИТ), протромбиновое и тромбиновое время, концентрация фибриногена и фибринолиз, т.н. Х11-а зависимый, в котором лизис фибрина плазмином активируется фактором Х11-а. Для исследования биохимических показателей использовалась сыворотка крови. У обследуемых животных изучались следующие показатели: содержание общего белка, альбуминов, общих липидов, холестерина, уровень кальция. Данные показатели определяли по общепринятым методикам с использованием реактивов фирмы «Ольвекс» (Россия), «Лахема»(Чехия) , «Витал» (Россия). Измерение оптической плотности исследуемых образцов сыворотки проводили на КФК-1. Результаты исследования. В таблице 1 представлены данные по системе гемостаза по обоим видам обезьян. Таблица 1 Данные по системе гемостаза у обезьян 2 видов. В 1 группе у павианов гамадрилов по АКТ наблюдалась активация в показателе А (26%), отражающем начальный этап свертывания крови, по сравнению со 2 и 3 группами. У макак резусов наибольшая активность этого показателя выявлялась во 2 и 3 группах (31 и 33%) у самок. МА – максимальная свертывающая активность крови у всех павианов гамадрилов независимо от возраста и пола происходила на 6 или 8 минутах инкубации гемолизат-кальциевой смеси и составляла 56-60%, а у макак резусов – до 67%. Вместе с этим повышалось содержание ингибиторов свертывания, судя по индексу инактивации тромбина (ИИТ) в АКТ (до 2.9%) у обезьян обоих видов в 1 и 2 группах, однако в старшей возрастной группе этот показатель был самым низким (1,5-1,7%). Протромбиновое время плазмы – тест, позволяющий обнаружить нарушения во внешнем механизме образования протромбиназы. Наиболее короткое время отмечалось в группе макак резусов (15,2 сек), а у павианов преимущественно у самок всех возрастных групп. Тромбиновое время отражает наличие ингибиторов свертывания в плазме крови. Показатель изменялся у павианов среднего и старшего возраста ( 13,4 сек), в группе макак он составлял всего 11-12 сек. Концентрация фибриногена была повышена у обоих видов животных преимущественно в старших возрастных группах до 6 г/л, а у макак резусов даже до 6,8 г/л. Оценка фибринолиза выявила удлинение времени лизиса сгустка фибрина параллельно возрасту, достигая 29-32 минуты в 3 группе. Для выявления видовых различий мы провели соответствующий анализ. Результаты представлены в таблице 1. Наиболее активно гемокоагуляция происходит у обезьян вида макак резусов на фоне сниженной инактивации процесса (данные по ИИТ в АКТ и тромбиновому времени). Следует полагать, что такая гиперкоагуляционная тенденция в крови обследованных нами клинически здоровых обезьян отражает нормальное состояние гемокоагуляции и не может служить препятствием для использования в экспериментах. Из литературы известно, что у обезьян вида макак резусы более активный гемокоагуляционный процесс, чем у других видов обезьян и человека [4,6,7]. Существенным дополнением к оценке активности гемокоагуляции имеет определение уровня других биохимических показателей, таких как общий белок, альбумины, общие липиды, холестерин, кальций. Для этого мы провели параллельное исследование данных показателей. Полученные результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Биохимические показатели крови обезьян обоих видов. Содержание холестерина у макак резусов в 1 группе (5-10 лет) было в 1,5 раза выше в сравнении со 2 и 3 группами (4,7;2,9;2,85 ммоль/л). Уровень общих липидов не отличался во всех трех возрастных группах (8,2; 7,75;6,85 г/л). В содержании общего белка и альбуминов также не отмечено существенных различий. Значения кальция во всех трех обследованных группах колебался в пределах от 2,1 до 2,4 ммоль/л. У павианов гамадрилов уровень холестерина во всех трех обследованных группах не отличался и составил в среднем 2,63; 2,8;2,45 ммоль/л, соответственно. Содержание общих липидов колебалось в пределах от 4,5 до 5,05 г/л. Существенных отличий не отмечено и по остальным исследованным показателям. Анализ полученных данных при распределении животных по половому признаку показал, что содержание холестерина у самок и самцов макак резусов 1 группы не отличалось и составило 4,7+0,79; 4,63+0,36 ммоль/л, соответственно. Аналогичная картина наблюдалась во 2 группе. В 3 группе уровень холестерина был несколько выше у самок по сравнению с самцами той же возрастной группы (2,44;3,3 г/л). Содержание общих липидов у самок 1 и 2 группы было выше, по сравнению с самцами соответствующих возрастных групп. В 3 группе более высокие значения общих липидов отмечались у самцов. По показателям общего белка и альбуминов не отмечено различий как внутри возрастной группы, так и при сравнении 3 возрастных групп. У павианов гамадрилов также не отмечено существенных различий в показателях холестерина, общего белка, альбуминов и кальция как внутри возрастной группы, так и в сравнительно-возрастном аспекте. Уровень общих липидов был несколько выше у самцов павианов 2 возрастной группы по сравнению с 1 и 3 группами. Проведение анализа изученных показателей у обезьян в межвидовом аспекте показало, что содержание холестерина и общих липидов у макак резусов были выше, чем у павианов гамадрилов, что по-видимому объясняется видовыми особенностями. По остальным исследованным показателям не отмечено межвидовых различий. Выводы: 1. Разработанный алгоритм для диагностики состояния системы гемостаза и ряда биохимических показателей позволяет адекватно судить о состоянии здоровья обезьян – павианов гамадрилов и макак резусов при планировании экспериментальных воздействий. 2. Гиперкоагуляционная направленность в крови макак резусов не является артефактом, а служит характеристикой нормального состояния гемокоагуляции. 3. Возникновению тромбозов в крови здоровых обезьян противостоит адекватная антикоагулянтная активность плазмы крови. 4. Биохимические параметры крови макак резусов и павианов гамадрилов, характеризующие различные функциональные системы организма соответствуют нормальным колебаниям, в том числе и у обезьян старшей возрастной группы. Список литературы. 1. Анненков Г.А. Белки сыворотки крови / Москва «Медицина»,1974 2. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза// Кафедра КЛД, Москва,2005 3. Машкевич Л.С., Коробейникова Э.Н. Сравнительное содержание общего белка, белковых фракций,липопротеидов в сыворотках крови обезьян // Материалы конференции физиологов. биохимиков, Уфа,1976г. 4. Фоменко В.Н., Шария М.И. Гиперкоагуляция у здоровых обезьян макак резусов и павианов гамадрилов Сухумского питомника // Материалы 111 Международной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа». Нальчик,2004,т.2, 161-167 5. Черкович Г.М., Узунян Л.А. Сыворотка крови у обезьян (павианов и макак), его сезонные изменения и связь с уровнем основного обмена // Bd.9 ,1967, 236-242 6. Schenone M. et al The blood coagulation cascade // Curr. Opin.Hematol. 2004,11 (4), 272-277 7. Seamon A. Malinow M.R. Blood clotting in nonhuman primates // Zab. Anim. Care, 1968, 18, 1, 80-84 CHARACTERISTICS OF BIOCHEMICAL INDICES OF BLOOD IN HAMADRYAS BABOONS AND RHESUS MONKEYS OF SUKHUMI MONKEY COLONY: COMPARATIVE AGE-RELATED ASPECTS Fomenko V.N., Khashig N.E., Barkaya V.S., Aleksyan A.A., Dzikirba R.R., Sabekiya Zh.D., Dzheliev.L.I. [Institute of Experimental Pathology and Therapy ASA] The investigation was carried out in two monkey species – hamadryas baboons (35) and rhesus monkeys (62) .Three different age-groups of monkeys were subdivided into the sugroups according to sex. The data presented have been obtained for the period of 2008-2010. In the investigated animals the tendency to hypercoagulation was increasing with age. This process was the most active in rhesus monkeys against the background of the decreased inactivation of coagulation with the increase of fibrinogen level and marked inhibition of fibrinolysis. According to the values for total protein, albumins, and calcium no significant interspcies and sexual differences were found. The values for cholesterol and total lipids were slightly higher for females of older age groups. A tendency to hypercoagulation is an evolutionally conditioned process of coagulation activation limiting a possible bleeding during the frequent traumas, that is, it is a normal state for monkeys not restricting the use of these animals in the biological experiments. Biochemical blood parameters of rhesus monkeys and hamadryas baboons characterizing different functional systems of the organism are in the range of normal variations in monkeys including the individuals of older age groups. «ИНФЕКЦИОННАЯ ПАТОЛОГИЯ, ИММУНОЛОГИЯ И ОНКОЛОГИЯ» МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНКОЛОГИЯ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ, БУДУЩЕЕ. Ф.Л.Киселёв Российский Онкологический Научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН Рак – заболевание генетического аппарата клетки. Для всех изученных в настоящее время опухолей характерны изменения в структуре, функциях или регуляции определенных генов и эти изменения носят специфический характер. Молекулярная онкология, наука, связанная с изучением генома клеток, является в настоящее время одной из главных составляющих для понимания причин возникновения опухолей, их метастазирования, ранней диагностики, определения тактики лечения и прогноза заболевания. Истоки появления такой науки как молекулярная онкология следует искать во второй половине прошлого века. Эти исследования базировались на многочисленных теориях и концепциях о происхождения опухолей, которые в то время широко обсуждались и подвергались экспериментальной проверке. Эти теории, как правило, отвергались, но определенные рациональные зерна этих теорий оставались в памяти. К ним следует отнести теории, связанные с ролью канцерогенов в развитии опухолей и тесно связанные с этим мутагенные эффекты в этом процессе, идею о существовании внехромосомного наследственного иещества в опухолях, роль радиоактивного облучения в индукции лейкозов и сарком, возможной роли гормонов и иммунологических факторов, теории раздражения клеток, теории эмбриональных зачатков, теории Варбурга (роль гликолиза), идеи о роли эндогенных канцерогенов, идеи о роли вирусов или других инфекционных агентов в развитии опухолей. В 50-60-х годах прошлого века стало наиболее вероятным, что две теории в наибольшей степени отвечают существовавшим в то время представлениям о происхождении опухолей. Первая их них – теория химического канцерогенеза, и вторая – вирусная теория происхождения опухолей. Идеологом первой из них в отечественной онкологии был Л.М.Шабад, а идеологом вирусной теории был Л.А.Зильбер. Именно идея о вирусном происхождении опухолей дала первый толчок в разработке молекулярных механизмов злокачественной трансформации клеток. В первой половине ХХ века было выделено несколько вирусов, этиологически связанных с опухолями у птиц и млекопитающих (вирусы Рауса, Биттнера, Шоупа). Поэтому особое значение приобретает теория о вирусном происхождении опухолей человека, которая была предложена Л.А.Зильбером в 1942 г., когда он находился в заточении.. В 60-х годах эта теория получила дальнейшее развитие и была сформулирована как вирусо-генетическая теория происхождения опухолей. Л.А.Зильбер считал, что все опухоли возникают за счет вирусной инфекции. Вирус “работает” лишь на начальных этапах превращения нормальной клетки в опухолевую, на этом его функции завершаются и в сформировавшихся опухолевых клетках он не существует. Из этого следовало, что вирус должен индуцировать такие изменения в генетическом аппарате клетки, в результате которых рост клеток становится неуправляемым и возникает опухоль. Очевидно, что эволюция этой точки зрения была направлена на поиск новых вирусов, ассоциированных с опухолями человека, идентификации тех вирусных генов, которые способны вызывать трансформацию клеток, и на поиск мишеней действия этих генов, изменения в структуре и функциях которых вызывают нарушения в контроле и пролиферации клеток. Естественно предполагалось, что если имеет место вирусная инфекция, то возможна вакцинация против этих вирусов как один из путей профилактики рака. 60-80-ые годы ХХ века ознаменовались стремительным прогрессом в выделении и идентификации большого количества ДНК- и РНК-содержащих вирусов у различных классов и видов птиц и млекопитающих, ассоциированных с возникновением опухолей. На рубеже двух веков были выделены вирусы, этиологически связанные с опухолями человека (вирус Эпстайна-Барр, вирусы папиллом человека, вирус саркомы Капоши, вирусы гепатита В и С, вирус Т-клеточного лейкоза человека). Обнаружение этих вирусов дало в руки исследователей мощный инструмент, позволяющий получать молекулярные зонды для исследования судьбы вирусного генома в опухолях. Именно этот метод молекулярной гибридизации позволил R.Dulbecco, а затем и X. zur Hausen выявить последовательности вирусной ДНК в опухолях, индуцированных вирусами полиомы и герпеса. С другой стороны, этот подход позволил идентифицировать вирусные последовательности, ответственные за злокачественную трансформацию клеток. Необходимо отметить работы Л.А.Зильбера, И.Н.Крюковой с сотр., Г.Я. Свет-Молдавского с сотр., Б.А. Лапина с сотр., в которых было показано, что вирус Рауса кур способен преодолевать видовые барьеры и индуцировать опухоли у млекопитающих. Естественно, что работы, проведенные на приматах в Институте экспериментальной патологии и терапии в Сухуми (ныне Институт приматологии РМН в Сочи) имели и имеют в этом плане особое значение. Эти опыты открыли важную страницу в молекулярной онкологии, поскольку именно они послужили предпосылкой для доказательства участия ДНК в размножении РНК-содержащих вирусов (J.Svoboda), а в дальнейшем и открытия обратной обратной транскриптазы (H.Temin, D.Baltimore). Вскоре было показано, что геном вируса Рауса содержит специальный ген (онкоген) (M.Bishop, H.Varmus), который после клонирования обладал способностью к трансформации клеток in vitro. Позднее онкогены были идентифицированы во всех ДНК- и РНК-содержащих вирусах. Следующей страницей в молекулярной онкологии было открытие в нормальной клетке последовательностей, комплементарных вирусным онкогенам, и получивших название протоонкогенов (M.Baluda). При опухолевой конверсии происходит активация этих генов и они приобретают способность к злокачественной трансформации клеток in vitro. Эти данные позволили предположить, а затем и доказать, что в составе клеточного генома существуют последовательности, потенциально способные индуцировать клетки к неконтролируемому росту. После открытия онкогенов, функции которых сводятся к активации пролиферации клеток, были выявлены гены, которые обладают прямо противоположным эффектом, т.е. обладали способностью к подавлению клеточного роста. Эти гены получили название генов-супрессоров опухолевого роста и их ингибирующий эффект был подтвержден опытами на клеточных культурах. Наиболее изученными из них является ген р53 (A.Levine) и ген ретинобластомы (RB 105) (A.Knudson). Следующая группа генов, играющих ключевую роль в контроле клеточной пролиферации – это гены-регуляторы клеточного цикла (циклины и циклин-зависимые киназы) и группа ингибиторов этих киназ (р15, р16, р21, р27). В начале XXI века был расшифрован геном человека и это резко расширило возможности анализа молекулярных процессов, связанных с ролью определенных генов в канцерогенезе. Практически во всех исследованных опухолях в тех или иных генах были выявлены мутации различных типов. В настоящее время таких мутаций насчитываются сотни. Каждая опухоль характеризуется своим специфическим спектром мутаций. При этом выявлены кластеры мутаций, которые являются общими для опухоли данной нозологии, но существуют и уникальные мутации, характерные только для данной определенной опухоли. Использование данных по спектрам мутаций позволило осуществлять дополнительную (в дополнении к морфологической) диагностику опухолей и как следствие этого в определенных случаях проводить и дифференциальную диагностику. Данные по сиквенсному анализу ДНК в сочетании с лазерной микродиссекцией позволили получить информацию как о межопухолевой, так и внутриопухолевой гетерогенности. Мутации могут затрагивать многие гены и в ряде случаев в одном и том же гене могут выявляться несколько мутаций. Основная задача в настоящее время состоит в необходимости доказательств функциональной значимости выявленной мутации. Для опухолевых клеток, кроме изменений в структуре генов, характерны и многие эпигенетические изменения, при которых первичная структура гена остается без изменений, но нарушается регуляция его активности. Известны несколько типов таких нарушений: – изменение экспрессии гена. Этот феномен часто связан с уровнем метилирования. При гиперметилировании участков, обогащенных парой нуклеотидов Г/Ц, в областях промотора гена или его первого экзона, экспрессия этого гена подавляется. Это показано для многих генов в различных опухолях. Данное изменение является обратимым и может быть элиминировано действием деметилирующих агентов. – активация транскрипции генов в опухолевых клетках, причины которой пока не установлены. Классическим примером этого является теломераза, ключевой фермент, контролирующий процессы пролиферации в клетках. Этот ген “молчит” в нормальных клетках, но активируется в клетках иммортальных и продолжает активно работать в опухолях. – сплайсинг, когда один и тот же ген может кодировать различные изоформы РНК, и как следствие этого происходит синтез разных белков, иногда обладающих прямо противоположными функциями. - синтез так называемых малых РНК, которые кодируются, как правило, интронными областями генов. Эти РНК способны взаимодействовать с участками ДНК, контролирующими инициацию синтеза ДНК путем комплементарного взаимодействия. Биогенез РНК этого типа активно изучается. Все вышеизложенное свидетельствует о том, что комплексное изучение генетического аппарата клеток и его регуляции дали возможность использования этих данных в клинической практике. Исследования в области молекулярной клинической онкологии развиваются по нескольким основным направлениям: – молекулярная диагностика, которая позволяет верифицировать варианты заболевания, которые являются спорными и не поддаются точной верификации с помощью классических методов. Наличие определенных мутаций позволяет определять тактику лечения и избегать излишних и дорогостоящих химиотерапевтических процедур; - верификация наследственных раковых синдромов, что особенно четко разработано для опухолей молочных желез; - эффективная ранняя диагностика, но возможно использования в качестве прогностического фактора; - информация об активации определенных генов позволяет селективно использовать химиопрепараты и моноклональные антитела, многие из которых широко используются в качество моно- или мультитаргетной терапии, что существенно увеличивает эффективность лечения. На повестку дня поставлен вопрос о молекулярной химиопрофилактике рака; - открываются возможности создания эффективных вакцин нового поколения; первая такая вакцина против рака шейки матки уже широко используется в практике здравоохранения многих стран. Таким образом, молекулярная онкология за прошедшие 50-60 лет сделала гигантский шаг вперед – от зарождающейся науки она превратилась в её форпост со стремительно возрастающим внедрением в клинику. MOLECULAR ONCOLOGY: PAST, PRESENT, FUTURE F.L.Kisseljov N.N.Blokchin Cancer Research Center, Moscow, Russia Cancer is a disease of cellular genome. In all types of tumors or cancer cells propagated in vitro structural, functional or changes in regulation of specific set of genes were described, which are specific for each tumor. The pioneering experiments of P.Rous. J.Bittner and R.Shope describe the role of exogenous viral genes in tumor induction. L.Zilber in 1943 proposed the viral origin for all human tumors. He formulated so called viral-genetic theory of cancer origin (1966 year). Now several viruses are discovered that are associated with development of human tumors. First approach for the analysis of genomic changes in tumors was started by experiments of R. Dulbecco and H.zur Hausen. These studies were based on the technique of molecular bybridization to detect viral DNA in tumours induced by polyoma and Epstein-Barr viruses. The second important step was done by J Svoboda who proposed cellular DNA involvement in the replication of RNA-tumor viruses. Later H.Temin and D.Baltimore discovered RNA-dependent DNA polymerase (revertase) as an integral part of RNA tumor viruses. The next step was discovery of oncogene in RNA-tumor viruses, a specific gene with the capacity to transform cells in vitro (M.Bishop, H.Varmus). The homologues of these viral oncogenes (protooncogenes) were described in the genome of normal cells (M.Baluda). These experiments on viral models opened a new approach for the identification of cellular genes associated with tumor progression. In addition to oncogenes (that activate cell proliferation) another group of genes with quite diverse activity – tumor suppression, was described. The most well known among them was p53 (A.Levine) and retinoblastoma gene Rb 105 (A.Knudson). The third group of genes play a key role in carcinogenesis are regulators of cell cycle division (cyclines and cycline dependent kinases). In the beginning of XXI century the intact human genome was deciphered. This opened new opportunities for the analysis of cancer cell genome. Different mutations were described in all types of tumors and each tumor was characterized by a specific set of mutations. This discovery allows to search for specific agents against these changes (target therapy). For most of the genes participating in tumor conversion the epigenetic modifications are also well known. Among them are changes in gene espression ( in many cases it is associated with differences in methylation pattern), activation of gene transcription or silencing, RNA splicing, synthesis of so called small RNA with regulatory functions. These new approaches open new pages in such fields as molecular diagnostics, verification of hereditary cancer syndromes, effective early diagnostics, target therapy, development of new vaccines. DEVELOPMENT OF A MONKEY TUMORIGENICTY TEST AND A CELL LINE FOR VACCINE PRODUCTION John Petricciani Palm Springs USA Introduction Viral vaccine production initially used primary cell cultures as the substrate on which to propagate the virus. Examples include polio vaccine produced in primary monkey kidney cells and measles vaccine produced inchicken embryo fibroblasts. The development of human diploid cell lines such as WI-38 in the 1960s opened the door to the possibility of using such cell culture systems for vaccine production as an alternative to primary cell cultures(1). However, concerns were expressed about the safety of human diploid cells, primarily by Prof. Albert Sabin. His major objection to the use of human diploid cells for viral vaccine production centered around the theoretical possibility that they might contain a human oncogenic agent which, if present, would be transmitted to the recipients of any vaccine produced in such cells(2). Others in the scientific community believed that primary cells, especially those from nonhuman primates, carried a much greater risk of transmitting contaminating viruses than did human diploid cells. As a result of this controversy, a recommendation was made that the U.S. National Institutes of Health (NIH) should undertake a nonhuman primate diploid cell development effort with the aim being to establish an alternative to human diploid cells (3). That program began in the early 1970s and was successful with the development of a fetal rhesus diploid cell line, FRhL-2(4). Among the various tests that were used to evaluate and characterize new cell substrates, an assessment of the tumorigenic potential of the cells was considered to be very important. In fact, for many years, each batch of WI-38 cells used to produce polio vaccine was tested for tumorigenicity. The ideal test would be to inoculate the cells back into the immunosuppressed donor. This is impossible for any cell line derived from fetal tissue, but the possibility of using the homologous species for tumorigenicity testing of monkey diploid cell lines would be the next best alternative.In the case of human diploid cells, monkeys provide a primate model for testing tumorigenicity. Prof Lapin and his colleagues demonstrated quite clearly, starting in the 1960s, that monkeys could be used to assess the potential for carcinogens, viruses, and radioactive substances to induce tumors. The studies described here build on that experience and show that immunosuppressed monkeys are a sensitive host for assessing the tumorigenic potential of inoculated cells. Monkey diploid cell line development The primary goal of this study was to develop and characterize diploid cell lines that could be used for vaccine production from the fetal tissues of rhesus and African green (AG) monkeys. A total of 28 cell lines were established from fetal tissues of lung, skin, heart, muscle, and kidney (5).Cell lines from lung tissues appeared to have the greatest growth potential in terms of total doublings, and fibroblastic cell lines derived from rhesus monkeys were usually capable of more doublings than similar lines from AG monkeys. Rhesus monkey fibroblasts were maintained in active growth phase during 6 to 8 months and 44 to 60 culture passages; AG monkey fibroblasts maintained active cell multiplication during 3 to 6 months and 16 to 40 passages.Four of 7epithelioid lines established from fetal monkey kidney tissue showed morphological and chromosomal evidence consistent with indefinite growth potential in culture. One cell line derived from fetal lung tissue of a rhesus monkey (FRhL-2) retained diploid characteristics. This cell line was studied extensively with regard to the following characteristics: cytogenetics, viral susceptibility, tests for adventitious agents, and tumorigenicity (4).In summary, results showed that the cells: 1) maintained diploid characterisitcs until senescence; 2) were susceptible to polio, rubella, rabies, mumps, and vacciniaviruses; 3) were free from detectable adventitious agents; and 4) were not tumorigenic in immunosuppressed rodents and monkeys. Subsequently, FRhL-2 cells were used for the production of rabies, rotavirus, and Dengue virus vaccines. Monkey tumorigenicty test development Sincerodents immunosuppressed with antilymphocyte serum had been used successfully to assay for cell tumorigenicity, monkey antithymocyte globulin (ATG) was used to immunosuppress monkeys. ATG preparation ATG was prepared in rabbits from the thymocytes of rhesus and African green monkeys (6). Cells inoculated The following tumor cell lines were inoculated into monkeys: KB (human epidermoid carcinoma); HeLa (human cervical carcinoma); Hep-2 (human laryngeal carcinoma); WiDr (human colon adenocarcinoma); and Led-T1 (human fibroblasts transformed with SV40 virus). The vaccine cell substrates that were tested included: primary kidney cells from rhesus and AG monkeys and rabbits, primary chick and duck embryos, and diploid cell lines WI-38 and FRhL-2. Methods of inoculation ATG (13-50 mg/kg) was injected subcutaneously on the abdomen of test monkeys the day before inoculation of the cells and ondays 1 and 3. Newborn or infant monkeys received 50 mg/kg ATG at each injection, whereas the juveniles received a maximum of 40 mg/kg ATG at each injection. Cell suspensions were inoculated intramuscularly into the midbicepson day 0. Two control animals received only medium, and two additional controls were inoculated with KB cells only. An open biopsy of the inoculation site was performed between days 9 and 16, even without gross evidence of tumor formation. Results The potency of a batch of ATG was demonstrated by prolongation of skin grafts as well as consistent development of tumors in test monkeys whereas control month's not conditioned ATG did not develop tumors. In addition ATG produced against African green thymocytes was effective when used in rhesus monkeys. Two juvenile ATG-treated rhesus monkeys were inoculated with 107, 106, 105, and 104 KB cells in the right arm, left arm, right leg, and left leg, respectively, to determine the smallest number of KB cells that would grow progressively in this system, There was a graded response, with the 107 inoculum producing a large, progressively growing mass (about 5 x 3 x 3 cm), whereas the 104 inoculum produced only a small but palpable nodule that regressed by 2 weeks. In all animals the tumor was clearly viable until approximately 10-15 days after inoculation, and then encapsulation and lymphocytic infiltration progressively increased. The central portion of the tumor mass underwent necrosis and the tumor cells at the periphery became increasingly pyknotic. Complete regression occurred by 4-6 weeks, which is similar to the observation made by Prof Lapin and colleagues of tumor regression in monkeys inoculated with Rous sarcoma virus (7). No differences were observed in the extent of KB tumor development in those animals receiving 13 or 50 mg ATG/kg, and newborn, infant, or juvenile monkeys served equally well as hosts for the KB cells. Extending the ATG treatment to days 5 and 7 had no effect on tumor development or its duration as a palpable mass. Two rhesus infants also developed metastatic tumor in a draining axillary lymph node. An example of tumor development at the site of inoculation is shown in Figure 1. Table 1 summarizes our experience with various cell lines in ATG-treated monkeys. Table 1. Summary of tumorigenicity tests results in ATG-treated monkeys. Cells types inoculated No. tumors / No. inoculated Tumor cells KB 38/38 HeLa 3/3 Hep-2 6/6 WiDr 6/6 Led-T1 5/5 Total tumor 58/58 Vaccine substrate cells 0/40 Figure 1.Tumor biopsy of a rhesus monkey treated with ATG and inoculated intramuscularlywith 107WiDr cells (human adenocarcinoma) 10 days earlier.Tumor cells with frequent mitotic figures are clustered in gland-like structures typical for adenocarcinoma. H&E x 630. Discussion The immunosuppressive effect of ALS and ATG has been demonstrated in skin grafting, in tumorinduction by oncogenic viruses, and in tumor formation after heterotransplantation of tumor cells. This study shows that monkeys treated with ATG are a sensitive in vivo assay system for the tumorigenic potential of a cell line. While tumors could be produced with cell inocula as low as 104 tumor cells, the results with an inoculum of 107 cells were so clear and uniformly reproducible, as indicated in figure 1 and table 1, that we selected 107 as the standard inoculum. The positive correlation of tumor size with the size of the inoculum suggests that increasing the amount of foreign antigen does not result in a more vigorous host response when the animal is conditioned with ATG. This is strongly supported by the development of metastatic tumor in several of the animals. However, even in those animals, the primary intramuscular tumor mass disappeared about 6 weeks after the original inoculation of tumor cells. The results with cells derived from human neoplasms as well as with a virus-transformed cell line were in marked contrast to monkey and human diploid cells and various primary cells used for vaccine production. The nonhuman primate offers a very sensitive assay for assessing the tumorigenic potential of new cell substrates being considered for vaccine production. Acknowledgements This work was carried out when the author was in the Laboratory of Pathology at the Division of Biologics Standards, NIH. I am very grateful to DrInessaLevenbook for her helpful comments and suggestions during the development of the manuscript. References 1. Hayflick L and Moorhead, PS. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 25:58H21, 1961 2. Sabin AB. Discussion. Nat Cancer Inst Mono 29:378,1968. 3. Merchant DJ. Nat Cancer Inst Mono 29:583,1968. 4. Wallace RE, Vasington PJ, Petricciani JC, Hopps HE, Lorenz DE, Kadanka Z. Development of a diploid cell line from fetal rhesus monkey lung for virus vaccine production. In Vitro8(5):323-32, 1973 5. Wallace RE, Vasington PJ, Petricciani JC, Hopps HE, Lorenz DE, Kadanka Z. Development and characterization of cell lines from subhuman primates. In Vitro8(5):333-41,1973. 6. Petricciani JC, Kirschstein RL, Wallace RE, Martin DP. Assay for cell tumorigenicity in subhuman primates treated with antilymphocyte globulin. J Natl Cancer Inst. 48(3):705-13, 1972. 7. Lapin B.A. Results and prospects of medical-biological research in primates. In: Biull Eksp Biol Med. 1966 Sep;122(9):245-52. /Лапин Б.А.  Итоги и перспективы медико-биологических исследований на приматах. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1966; 122;9:245-52. В23/НУКЛЕОФОЗМИН И С23/НУКЛЕОЛИН – МАРКЁРЫ ТЕМПА РОСТА И СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ КАРЦИНОИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЛЁГКОГО Букаева И.А., Райхлин Н.Т., Пономарёва М.В., Смирнова Е.А., Чекини А.К., Павловская А.И. Шабанов М.А Российский Онкологический Научный Центр им. Н.Н.Блохина РАМН, 115478, Москва, Россия Введение Нейроэндокринные опухоли (НЭО) – это большая группа новообразований одного гистогенеза, но различного типа (морфологического строения, степени малигнизации, способности к метастазированию, агрессивности течения, лекарственной чувствительности и пр.), встречающихся практически во всех органах. Чаще всего нейроэндокринные опухоли обнаруживаются в лёгочной ткани, где они составляют 65.59% от всех новообразований этого типа, наблюдающихся в других органах. Согласно последней классификации НЭО, разработанной ВОЗ (2004 г), в лёгких выделяют следующие варианты данных новообазований: типичные и атипичные карциноиды (составляют 11,06% от всех НЭО дыхательной системы), мелкоклеточные и крупноклеточные раки (составляют 88,63% и 0,28% НЭО лёгких).Следует подчеркнуть, что встречаемость карциноидов дыхательной системы (трахея, бронхи, лёгкие) за последние 50 лет увеличилась с 10,2% до 25,6 %.Впервые Оберндорфер в 1907 г. описал своеобразные опухоли тонкой кишки и предложил для их обозначения термин «карциноид», что значит карциноподобный.В этой работе Оберндорфер писал, что «карциноиды- это небольшого размера множественные опухоли, потенциально инвазивны, не метастазируют и очень медленно растут, в связи с чем не опасны».Через 22 года в 1929 г. Оберндорфер на основании исследования 36 карциноидов аппендикса и тонкой кишки публикует работу, в которой пересматривает свою первоначальную оценку доброкачественного поведения опухолей этого типа и подтверждает возможность того, что карциноиды способны проявлять свойства злокачественных опухолей и метастазировать.В соответствии с градацией НЭО по степени злокачественности для типичных карциноидов характерна низкая степень злокачественности (G1), для атипичных- средняя (G2), для мелкоклеточных и крупноклеточных раков – высокая (G3).Агрессивность, долгосрочный прогноз и другие особенности клинического поведения этих опухолей зависят от их индивидуальных биологических свойств, одним из важнейших показателей которых является пролиферативная активность опухоли. Маркёром количества пролиферирующих клеток. как известно, является индекс Ki-67 (MIB-1), который широко применяется, рекомендован рядом Международных классификаций как показатель степени злокачественности опухоли. Однако, в литературе имеются работы, в которых показано, что индекс Ki-67 не всегда соответствует клиническому поведению опухоли, иногда при низком значении индекса Ki-67 опухоль имеет более агрессивное течение, чем аналогичное, но с более высоким индексом Ki-67.Кроме количества пролиферирующих клеток в оценке пролиферативной активности в целом важное значение имеет скорость прохождения клетками митотического цикла. Главными регуляторами скорости прохождения клетками фаз клеточного цикла являются аргирофильные белки областей ядрышковых организаторов - В23/нуклеофозмин (В23/НФ) и С23/нуклеолин (С23/НЛ). Задачи исследования Учитывая вышеизложенное, задачей настоящей работы явилось изучение влияния на пролиферативную активность в целом количества пролиферирующих клеток (индекс Ki-67) и скорости прохождения клетками митотического цикла (экспрессия аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов – В23/НФ и С23/НЛ. Материалы и методы Материалом для работы послужили 18 карциноидов лёгкого, в том числе 13 типичных и 5 атипичных . Разграничение карциноидных опухолей на типичные и атипичные проводили в соответствии с требованиями классификации ВОЗ (2004г). Карциноидные опухоли, в которых число митозов было <2 в 10п/зр. при большом увеличении (Х 400) и в которых отсутствовали некрозы были расценены как типичные карциноиды; опухоли, в которых число митозов было от 2 до 10 в 10 п/зр. и в которых отмечалось наличие некрозов были расценены как атипичные. Было проведено морфологическое и электронномикроскопическое исследование этих опухолей, а также иммуногистохимическое исследование экспрессии антигена Ki-67 и белков В23/НФ и С23/НЛ и гистохимическое исследование Ag-ОЯОР-белков с применением нитрата серебра. Для определения индекса Ki-67 при большом увеличении (х400) проводили подсчёт количества окрашенных клеток и общего числа клеток (не менее 1000); уровень экспрессии определяли как отношение числа окрашенных к общему числу клеток и выражали в процентах. При иммуногистохимическом исследовании белков В23/НФ и С23/ НЛ оценивалась интенсивность реакции ( низкая, умеренная, высокая).При гистохимическом исследовании Ag-ОЯОР-белков подсчитывали среднее количество гранул серебра в клетке. Кроме того с диагностической целью иммуногистохимически были исследованы маркеры НЭО – хромогранин А и синаптофизин. Результаты исследования В результате проведенного исследования было обнаружено, что типичные и атипичные карциноиды лёгкого характеризовались сходным морфологическим строением. Опухолевые клетки обоих вариантов карциноидов формировали трабекулярные, гнёздные, розеткоподобные, псевдожелезистые и др. структуры. Электронно-микроскопическое исследование карциноидных опухолей лёгкого показало, что их основным ультраструктурным диагностическим признаком является наличие нейроэндокринных гранул в цитоплазме опухолевых клеток, количество которых отражает степень дифференцировки (в типичных карциноидах гранул больше, чем в атипичных). Кроме того в атипичных карциноидах характер ядерной мембраны, в отличие от типичных, где она ровная, имеет глубокие инвагинации. Насыщенность цитоплазмы опухолевых клеток органоидами снижается по мере нарастания степени злокачественности и увеличивается количество опухолевых клеток с тёмным матриксом. В опухолевых клетках выявлялась экспрессия нейроэндокринных маркеров- хромогранина А и синаптофизина. Типичные карциноиды. При гистохимическом исследовании в клетках большинства типичных карциноидов (в 10 из 13 наблюдений) выявлялась низкая или умеренная экспрессия Ag-ОЯОР-белков. Количество гранул серебра на ядро клетки в среднем составляло 2,8±0,3. При иммуногистохимическом исследовании в клетках карциноидов этой группы отмечалась преимущественно умеренная экспрессия В23/НФ , тогда как в 3 случаях отмечена низкая экспрессия этого белка.Экспрессия С23/НЛ , напротив ,была чаще низкой (в 7 наблюдениях), умеренная экспрессия С23/НЛ была зарегистрирована в 3 наблюдениях. Среднее значение индекса Ki-67 было 2,3±0,12% ( с колебаниями от 2 до 5%). Отдельно необходимо остановиться на 3 случаях из этой группы карциноидных опухолей. Особенностью одного из них было наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах.Анализ экспрессии Ag-ОЯОР-белков в клетках этой опухоли показал,что среднее число гранул на 1 ядро составляло 9,2±0.37, что превышало средние значения, установленные для типичных карциноидов в 3,2 раза В клетках этой опухоли отмечалась повышенная коэкспрессия В23/НФ и С23/НЛ. В двух других наблюдениях показатели экспрессии Ag-ОЯОР-белков были также повышены. В одном случае среднее число гранул серебра составляло 8,9±0,37, что превышало в 3,1 раза показатели, становленные для типичных карциноидов. В другом случае среднее число гранул на ядро составляло 6,5±0,58, что превышало средние значения в 2,3 раза. однако в этих опухолях, в отличие от метастазирующей, экспрессия только одного из главных Ag-ОЯОР-белков-В23/НФ- была высокой, в то время как экспрессия С23/НЛ была низкой, как и в большинстве типичных карциноидов. При истохимическом исследовании этих опухолей встречались отдельные клетки, в ядрах которых содержалось 12 и более гранул серебра, что могло свидетельствовать о появлении быстро пролиферирующих клеток. Индекс Ki- 67 в двух опухолях был несколько выше средних значений и составлял 3 % в метастазирующей и 5 % в другой опухоли; в 3-ей опухоли из этой группы индекс Ki-67 находился в пределах средних значений и составлял 2%. Атипичные карциноиды. В клетках атипичных карциноидов среднее число гранул серебра составило 6,2±0,47 на ядро, что было в 2,2 раза выше по сравнению с типичными карциноидами. В 3 атипичных карциноидах отмечался высокий уровень экспрессии Ag-ОЯОР-белков; в 2 других уровень экспрессии был умеренным. Наиболее высокая экспрессия Ag-ОЯОР-белков была зарегистрирована в клетках метастазирующей опухоли, где среднее число гранул на 1 ядро было 10,5±0,37. Экспрессия В23/НФ в клетках всех исследованных атипичных карциноидов была высокой .Экспрессия С23/НЛ в 3 опухолях была умеренной, а в 2 опухолях, одна из которых была метастазирующей, отмечен высокий уровень экспрессии этого белка. В атипичных карциноидах индекс Ki-67 составлял 7,2,±0,68% и был в пределах от 2-20%. Наиболее высокий индекс Ki-67 отмечен в метастазирующей опухоли, где он равнялся 20% Заключение Существующие дифференцильно-диагностические трудности типичных и атипичных карциноидов диктуют поиск новых критериев, объективно отражающих степень злокачественности и особенности их биологического поведения.В последние годы в качестве маркеров злокачественной трансформации клеток интенсивно изучаются Ag –ОЯОР-белки. При исследовании злокачественных опухолей разных локализаций и гистогегнеза было выявлено повышение в них экспрессии Ag-ОЯОР-белков и главных их составляющих – В23/НФ и С23/НЛ по сравнению с соответствующими нормальными тканями, дисплазиями и доброкачественными опухолями. Установлено, что чем интенсивнее экспрессия Аg-ОЯОР-белков, тем выше скорость клеточной пролиферации, а в активно пролиферирующих клетках выявлена суперэкспрессия этих белков.Снижение уровня Ag-ОЯОР-белков, напротив, приводит к замедленному прохождению митотического цикла и аккумуляции клеток в G1 – и G 2-фазах. В связи этим интенсивность экспрессии Ag-ОЯОР- белков рассматривают как маркер скорости клеточной пролиферации- важный показатель степени злокачественности новообразований, темпа роста опухолей, определения их прогноза и дифференциальной диагностики. Проведенное нами исследование показало, что чем выше был уровень экспрессии Ag-ОЯОР-белков, тем выше степень агрессивного течения карциноидных опухолей лёгкого. В большинстве типичных карциноидов отмечалась умеренная экспрессия В23/НФ и низкая экспрессия С23/НЛ, тогда как в атипичных карциноидах постоянно отмечалась высокая экспрессия В23/НФ и умеренная экспрессия С23/НЛ .Внутри каждой группы карциноидов были отдельные опухоли, отличавшиеся более высокой экспрессией Ag-ОЯОР-белков, среди которых были метастазирующие опухоли. Особенностью метастазирующих карциноидных опухолей являлась повышенная коэкспрессия белков В23/НФ и С23/НЛ. Известно, что С23/НЛ является также белком, определяющим инвазивные свойства клеток. В опухолевых клетках около 5% С23/НЛ локализовано на клеточной поверхности, где он функционирует как рецептор для ряда лигандов, в том числе и для молекул, вовлеченных в контроль адгезии, миграционной активности, инвазии и метастазирования. В этой связи можно предполагать, что появление выраженной экспрессии С23/НЛ в клетках карциноидных опухолей создаёт условия для усиления их миграционной активности, что способствует клеткам осуществлять инвазию и метастазирование. В нашем исследовании в типичных карциноидах индекс Ki -67 был низким и составлял в среднем 2,3±0,12%(колебания от 2 до 5%); в атипичных карциноидах этот показатель составлял 7,2±0,63% и был в более широких пределах колебаний (от 2 до 20%). Сходные значения индекса Ki -67 в карциноидных опухолях были получены и другими авторами. В настоящее время общепринятых значений этого показателя для данной группы опухолей не существует. Так, по одним данным в типичных карциноидах индекс Ki-67 составляет 20%, а в атипичных индекс Ki-67 находится в пределах 20-50% ; по другим данным в типичном карциноиде индекс Ki-67 <5%, а в атипичном карциноиде находится в пределах 5-20%. В классификации ВОЗ (2004) отмечается, что Ki-67 позитивные клетки встречаются чаще в атипичном карциноиде, чем в типичном. Не исключено, что колебания значений индекса Ki-67 в карциноидных опухолях могут быть связаны с разным статусом p16/циклинD/pRb-пути (pRb –пути), контролирующего вступление клеток в G1-фазу. Ключевым компонентом этого пути является опухолевый супрессор pRb. В активном (дефосфорилированном) состоянии он блокирует прохождение митотического цикла. Показано, что в карциноидных опухолях может наблюдаться нарушение pRb-пути, при этом в типичных карциноидах по разным данным до 15% опухолей характеризуются повышенной экспрессией активированного циклина Д, что сопровождается инактивацией pRb и как следствие усилением пролиферации клеток. Другие компоненты этого пути остаются интактными. В атипичных карциноидах нарушения pRb- пути более часты и кроме повышения экспрессии циклина Д в них наблюдается утрата экспрессии pRb и иногда повышается экспрессия циклина В регулирующего переход клеток в митоз. Таким образом, проведенное исследование показало, что степень злокачественности карциноидных опухолей лёгкого в значительной степени определяется интесивностью экспрессии ядрышковых аргирофильных белков- В23/нуклеофозмина и С23/нуклеолина, регулирующих скорость пролиферации Ki-67-положительных клеток, находящихся в митотическом цикле. В конечном счёте темп роста карциноидных опухолей и степень их злокачественности определяется соотношением количества пролиферирующих клеток (индекс Ki-67) и скоростью прохождения фаз митотического цикла (интенсивность экспрессии В23/ нуклеофозмина и С23/нуклеолина). Следует также подчеркнуть, что повышенная экспрессия этих двух белков способствует развитию метастазов. Различия в уровне экспрессии Ag-ОЯОР-белков могут быть так же маркером дифференциальной диагностики типичных и атипичных карциноидных опухолей лёгкого. B/23 NUCLEOPHOSMIN AND C23/NUCLEOLIN ARE MARKERS FOR THE NEOPLASTIC GROWTH POTENTIAL AND MALIGNANCY GRADE IN LUNG CARCINOID TUMORS I.A. Bukaeva, N. Raikhlin, M. Ponomareva, E. Smirnova, A. Chekini, A. Pavlovskaya, M. Shabanov Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow, Russia Differentiation typical (TCs) from atypical (ACs) carcinoid lung tumors is clinically important because treatment demands and prognosis for these types of carcinoid tumors are different. The difference between TCs and ACs is based on histological criteria that are not always correlated with the clinical outcomes that is why new prognostic markers are needed. Over the past years the evaluation of the argyrophilic nucleolar proteins associated with nucleolar organizer region (AgNOR-proteins) was introduced as a new marker of cancer cell proliferation. It was shown that the main AgNOR-proteins – B23/nucleophosmin (B23/NPM) and C23/nucleolin (C23/NL) are directly related to regulation of the rapidity of cell proliferation. A significant correlation was found between the AgNOR-protein expression and patient survival in a large variety of cancer types: the greater the AgNOR-protein expression, the worse prognosis. The evaluation of AgNOR –protein expression (rapidity of cell proliferation) together with those parameters defining the number of proliferating cells (i.e. growth fraction - Ki-67 index) can provide reliable information on neoplastic growth potential and also employed to establish malignancy grade and used to define prognosis in cancer patients. The aim of our study was to evaluate the rapidity of cell proliferation (expression of AgNOR-proteins - B23/NPM and C23/NL) and the number of proliferating cells (Ki-67 index) and to define their relation to malignancy grade of carcinoid tumors. The study comprised 18 cases of lung carcinoid tumors (13TCs and 5 ACs). The tumors have been diagnosed according to the 2004 WHO criteria for neuroendocrine tumors. The following parameters were evaluated: AgNOR-protein expression (histochemical AgNOR staining), expression of the main AgNOR-proteins - B23/NPM and C23/NL (by using corresponding monoclonal antibodies) and antigen Ki-67immunostaining. All tumor samples were also stained for chromogranin A and synaptophysin. In our study most TCs (10 of 13 cases) had low or moderate level of AgNOR-protein expression. The mean AgNOR-protein content in this group of carcinoid tumours was 2,8±0.3 silver granules/nucleus. Seven of the 10 cases of TCs showed predominantly moderate expression of B23/NPM and 3 cases showed low expression. On the contrary, C23/NL expression was low in the most TCs. ACs demonstrated higher AgNOR-protein expression and showed a 2,2 fold increase in AgNOR-protein expression in comparison to TCs. All ACs showed high B23/NPM expression; C23/NL expression was moderate in 3 of 5 cases of ACs and two cases had high expression. All TCs and ACs with nodal metastases showed high coexpression B23/NPM and C23/NL. The mean number of proliferating cells determined by Ki-67 index was 2,3±0,12% (range 2-5%) and 7,2±0,68% (range 2-20 %) in TCs and ACs, respectively. Thus, the present study show that malignancy grade of lung carcinoid tumors, in considerable degree, is determined by level of argyrophilic nucleolar protein expression - B23/NPM and C23/NL, controlling the proliferation rapidity of Ki-67 positive cells, i.e. cycling cells. Ultimately, the neoplastic growth potential and malignancy grade of carcinoid tumors are defined by correlation between the number of proliferating cells (Ki-67 index) and the length of cell cycle (value of B23/NPM and C23/NL). It should be also emphasized that high expression of AgNOR-proteins (B23/NPM and C23/NL) promote to arising of metastases. Determined differences in the level of AgNOR-protein expression may be a useful marker for distinguishing between TCs and ACs of the lung. ИЗУЧЕНИЕ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧНОСТИ СОЕДИНЕНИЯ IN-10, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, НА ЯВАНСКИХ МАКАКАХ Салимов Р.М., Федотов Ю.А., Дорожко О.В., Шипаева Е.В., Леонов А.А., Иванов Р.В. ГК «БИОПРОЦЕСС», Москва, Россия Противоопухолевая активность соединения IN-10 была подтверждена на ряде мышиных моделей ксенографтов опухолей человека, как чувствительных, так и резистентных к химиотерапии. Оценка острой токсичности соединения IN-10 при введении per os показала, что ЛД50 составляет у мышей 160 мг/кг; у крыс - 259 мг/кг. При изучении месячной токсичности у крыс было установлено, что максимальная безопасная доза составляет 20 мг/кг per os. Дозы 30 и 40 мг/кг оказывали дозозависимое гепато- и кардиотоксическое действие. При изучении возможного кардиотоксического действия было установлено, что соединение IN-10 не оказывает статистически значимого влияния на интервал Q-T кардиограммы у морских свинок через 5, 15, 30 и 60 минут после внутрибрюшинного введения в дозах 10, 20 и 30 мг/кг. Обязательным условием при проведении доклинических токсикологических исследований противоопухолевых лекарственных кандидатов является использование кроме грызунов и других видов животных - не грызунов (2). В соответствии с действующими нормативными документами (1) для изучения побочных эффектов и прогнозирования серьезных нежелательных явлений (СНЯ) у человека, а также уточнения максимально переносимой дозы и адекватного расчета начальной дозы для клинических исследований было проведено настоящее исследование хронической токсичности на обезьянах. Определяли максимальную безопасную дозу соединения IN-10 при его введении в течение 28 дней яванским макакам (Macaca fascicularis). Выбор доз осуществляли на основании проведенных ранее исследований. Минимальные терапевтические дозы соединения IN-10 при изучении на разных моделях ксенографтов опухолей человека у мышей составляли 15 (DLD1) и 20 мг/кг (Caki1). При пересчете этих величин с учетом коэффициентов площади поверхности тела для обезьян (3) предполагаемые минимально эффективные дозы составили 3 и 5 мг/кг. Как указано выше, максимально переносимая доза у крыс при месячном введении составляла 20 мг/кг. Экстраполяция этой дозы на обезьян даёт ожидаемую величину максимальной переносимой дозы 11 мг/кг. На основании этих данных по оценке хронической токсичности у обезьян были выбраны дозы 2,0; 5,0 и 8,0 мг/кг. Материалы и методы Эксперименты проводили на 24 половозрелых обезьянах вида Macaca fascicularis: 12 самцах и 12 самках массой 2360–4420 г. Обезьяны адаптировались к условиям содержания и персоналу в течение 1 месяца до начала экспериментальных процедур. Животных содержали в индивидуальных жилых клетках, оборудованных автоматическими поилками, при температуре в помещениях 18-220С. Кормление осуществляли сбалансированным брикетированным кормом, с добавлением фруктов, овощей, сладостей и яиц. Все исследования проводили в соответствии с требованиями Комитета по биоэтике. Были сформированы 4 группы обезьян по 3 самца и 3 самки в каждой: группа плацебо (0,2 % раствор гидроксиметилцеллюлозы) и опытные группы, которым вводили раствор IN-10 в 0,2 % гидроксиметилцеллюлозе в дозах 2,0; 5,0 и 8,0 мг/кг. Введение осуществляли перорально в объеме 2 мл, ежедневно, в течение 28 дней. В ходе эксперимента оценивали внешний вид животных, состояние шерстного покрова, адекватность поведения, общий клинический статус, состояние видимых слизистых оболочек. Ежедневно измеряли температуру тела и еженедельно оценивали массу тела. Проводили оценку нежелательных явлений (НЯ) – обильная саливация, рвотные позывы, бледность слизистых оболочек, диарея, судороги, а также СНЯ - повторяющаяся или неукротимая рвота, потеря сознания, симптомы острой сердечной недостаточности (одышка, цианоз), падение температуры тела, гибель. У контрольных и опытных животных до введения и через 2, 4 и 6 недель после начала введения определяли: гематологические показатели (количество эритроцитов, средний объем эритроцита, количество нейтрофилов, лимфоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, гематокрит и уровень гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина на эритроцит); показатели гемостаза (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время); биохимические показатели крови (общий белок, глюкоза, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, общий билирубин, креатинин, мочевина, альбумин, триглицериды, холестерин, глобулин). Результаты исследований оценивали по t-критерию Стьюдента с использованием программы Statistica 6. При анализе результатов данные представляли в процентах от уровня, зарегистрированного до начала введения IN-10. Результаты В группе животных, получавших соединение IN-10 в дозе 2 мг/кг, не наблюдали признаков токсичности. У обезьян, получавших 5 мг/кг соединения IN-10, на 9 день эксперимента проявились НЯ. У трех из них на 19 и 21 дни после начала введения IN-10 развились СНЯ, из-за которых животные были выведены из эксперимента. У обезьян, получавших соединение IN-10 в дозе 8 мг/кг, НЯ появились на 4 день введения. На 5-6-й день эксперимента зарегистрированы СНЯ. Пять обезьян этой группы, были выведены из эксперимента на 9-й день. Позднее (на 12-й день), ещё одна обезьяна также выведена из эксперимента из-за появления СНЯ. На 18 день исследования масса тела обезьян, получавших IN-10 в дозе 5 мг/кг, достоверно уменьшилась по сравнению с группой плацебо. В дозе 8 мг/кг потеря веса зарегистрирована на 14, 18 и 25 день исследования (рис.1, А). Было установлено, что на 8 день введения IN-10 в дозе 8 мг/кг происходило увеличение концентрации креатинина (рис.1, Б), а на 4 неделе после начала эксперимента - снижение уровня холестерина (рис.1, В). На 2 неделе исследования отмечали статистически значимое повышение концентрации гемоглобина у обезьян, получавших 2,0 и 5,0 мг/кг. В конце эксперимента этот показатель в данных группах не отличался от группы плацебо (рис.1, Г). Не зарегистрировано статистически достоверных изменений в других изученных гематологических и биохимических показателях, также как и в показателях гемостаза. А В Б Г Рисунок 1. Динамика массы тела (А), концентрации креатинина (Б), холестерина (В) и гемоглобина (Г) у обезьян после перорального введения IN-10 в дозах 2, 5 и 8 мг/кг. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; *- р<0.05, ** - р<0.01 по сравнению с плацебо в той же временной точке. Примечание: для группы 8 мг/кг вместо данных 2 недели приведены показатели 8 дня, поскольку обезьяны этой группы были выведены из эксперимента. Таким образом, изучение хронической токсичности соединения IN-10 у обезьян позволило установить, что максимально переносимой дозой является доза 2 мг/кг. Это существенно меньше максимально переносимой дозы в 11 мг/кг, полученной при экстраполяции результатов месячной токсичности изучаемого соединения у крыс. Результаты настоящего исследования позволяют более точно рассчитать начальную дозу для клинических исследований и минимизировать риск применения IN-10 у человека. Выводы 1. Максимальная безопасная доза соединения IN-10 при 28-дневном пероральном введении Macaca fascicularis составляет 2 мг/кг. Дозы 5 (50 %) и 8 мг/кг (100 %) дозозависимо вызывали СНЯ. 2. При изучении безопасности лекарственных кандидатов с небольшой терапевтической широтой можно рекомендовать проведение исследований на обезьянах. Список литературы 1. Методические указания по изучению общетоксического действия противоопухолевых фармакологических веществ в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. проф. Р.У. Хабриева. – М.: Медицина, 2005. - с. 170-191. 2. Guidance for Industry S9 Nonclinical Evaluation For Anticancer Pharmaceuticals U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration; Center for Drug Evaluation and Research (CDER); Center for biologics Evaluation and Research (CBER) March 2010 ICH. 3. Freireich E.J., Gehan E.A., Rall D.P., Schmidt L.H., Skipper H.E. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey, and man. Cancer Chemother Rep. 1966 May; 50(4):219-44. ОСТРЫЙ ЛИМФОБЛАСТНЫЙ ЛЕЙКОЗ: ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ И НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ Манчук В.Т., Смирнова О.В. НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск, Россия Острые лейкозы (ОЛ) представляют собой разнородную группу гемобластозов, которые характеризуются первичным нарушением функции костного мозга морфологически незрелыми бластными клетками с вытеснением ими нормальных элементов и инфильтрацией различных тканей и органов, благодаря способности их к миграции. Все ОЛ возникают из одной мутировавшей кроветворной клетки. Принадлежность бластных клеток к линии кроветворения, степень их дифференцировки обусловливают особенности течения лейкозов, его терапию, эффективность лечения и прогноз . ОЛ составляют около 3% всех злокачественных опухолей человека, а среди гемобластозов ОЛ занимает одно из первых мест по частоте встречаемости. В год заболеваемость ОЛ составляет в среднем 5 случаев на 100000 населения. 75% случаев заболевания выявляется у взрослых больных. При этом соотношение острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) к острым лимфоидным лейкозам составляет 6:1. У пациентов в возрасте 40 лет и старше 80% составляют ОМЛ, а у детей – острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). В связи с этим медиана возраста больных ОМЛ – 60-65 лет, а ОЛЛ – 10 лет. Нами был проведен анализ заболеваемости и структуры ОЛ в г. Красноярске и Красноярском крае по отчетам о состоянии помощи больных с заболеваниями системы крови за 2000 – 2004 годы, и по анализу годового отчета о работе гематологического отделения Краевой клинической больницы №1 за 2005. За период наблюдений (2000-2005гг.) заболеваемость ОЛ составила в среднем 4,5-5 на 100000 населения. Основную часть госпитализированных пациентов составляли больные с гемобластозами, при этом наибольшее количество случаев госпитализаций – это госпитализации больных по поводу терапии различных гемобластозов. Число госпитализированных больных с ОЛ варьировало в пределах от 14,8% до 18,4% от всех больных с гемобластозами. В целом наблюдалась тенденция к ежегодному увеличению больных с гемобластозами, и ежегодному увеличению количества госпитализаций больных гемобластозами. При анализе структуры больных было выявлено, что большинство больных с ОЛ – это новые пациенты. Наибольшее количество госпитализаций больных с ОЛ проводилось в стадии ремиссии, чем в стадиях первичной атаки и рецидива (р<0,05). Эффективность проводимой терапии у больных с ОЛ оценивалась по частоте полных клинико-гематологических ремиссий и летальному исходу у впервые заболевших больных в стадии первичной атаки. Анализируя показатели результатов лечения за 2000 – 2005 год, выявлено, что в Красноярске и Красноярском крае полные клинико-гематологические ремиссии у больных ОЛ достигались в 42,8 - 58,6% случаев, при этом летальный исход составлял от 24,3 – 40,5% случаев. Для сравнения в Российском научном гематологическом центре РАМН и зарубежных гематологических клиниках полные клинико-гематологические ремиссии достигаются в среднем в 75-85% случаев, а ранняя летальность составляет 8 – 12%. Для оценки результатов лечения больных ОЛ нами изучена общая 5-летняя выживаемость в группах пациентов за наблюдаемый период по методу Каплан-Майера. Общая 5-летняя выживаемость больных ОЛ составила 22%. Все полученные результаты свидетельствовали о необходимости дальнейшего комплексного изучения ОЛ в г. Красноярске и Красноярском крае с целью снижения ранней летальности, повышения числа полных клинико-гематологических ремиссий и повышения общей выживаемости в целом. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение особенностей функционирования клеток иммунной системы (лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов) у больных ОЛЛ до и после химиотерапии с выявлением особенностей реагирования метаболических ферментов лимфоцитов у этих больных. Материалы и методы: ОЛЛ диагностировался у 73 взрослых пациентов, при этом у 25 из них (34,2%) выявлялась первичная атака, у 26 больных (35,6%) – полная ремиссия после проведенной терапии и у 22 больных (30,2%) – повторный рецидив. Полная ремиссия у больных характеризовалась наличием в костном мозге не более 5% бластных клеток при нормальной его клеточности, отсутствовали лейкемические клетки в ликворе. Рецидив диагностировали при появлении в показателях миелограммы более 25% бластов после достигнутой ранее ремиссии. Контрольную группу составили 125 практически здоровых лиц. Оценку клеточного звена иммунитета проводили с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, HLA-DR. Концентрацию иммуноглобулинов класса A, M и G в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом, используя тест-системы ЗАО «Вектор-Бест». Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводили по ранее разработанным методикам (Савченко А.А., Сунцова Л.Н., 1989; Савченко А.А., 1991). Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ в лимфоцитах крови выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин) на 104 клеток. Оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов производилась по результатам спонтанной и индуцированной хемилюминесценции в течение 90 минут на 36 канальном хемилюминесцентном анализаторе «CL3604». Определялись время выхода на максимум (Тmax), максимальное значение (Imax), площадь кривой (S). В качестве индуктора респираторного «взрыва» использовался опсонизированный зимозан («Sigma», США). Усиление хемилюминесценции, индуцированной зимозаном, относительно спонтанной оценивали соотношением Sзим./Sспон. По результатам исследования в электронных таблицах MS Excel 2000 была сформирована база данных, на основе которой с помощью пакетов прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., 2004) производился статистический анализ методами описательной статистики с t-критерием Стьюдента, непараметрическим с использованием точных критериев Манна-Уитни. Результаты и обсуждение: В целом, при исследовании особенностей иммунного статуса больных ОЛЛ до начала проведения химиотерапии наиболее значимые изменения выявлены на стадии ремиссии. Состояние клеточного иммунитета у больных на стадии атаки характеризовалось повышением абсолютного содержания лимфоцитов и снижением относительной концентрации Т-клеток. У больных снижена величина иммунорегуляторного индекса. При ремиссии ОЛЛ на фоне снижения процентного и абсолютного содержания лимфоцитов в крови понижались относительное и абсолютное количество Т-лимфоцитов, абсолютный уровень NK-клеток, В-лимфоцитов и лимфоидных клеток, экспрессирующих маркер HLA-DR. Снижение количества Т-лимфоцитов у больных происходило за счет понижения в процентном и абсолютном содержании CD4+- и цитотоксических Т-лимфоцитов. Единственным показателем иммунного статуса, величина которого восстанавливалась при ремиссии ОЛЛ, является иммунорегуляторный индекс. При рецидиве ОЛЛ большинство исследуемых параметров иммунного статуса восстанавливалось до контрольного уровня. На данной стадии патологического процесса сохранялось только снижение относительного содержания Т-лимфоцитов. Особенностью данной стадии являлось увеличение в периферической крови больных процентного содержания NK-клеток, что, вероятно, является компенсаторной реакцией на рост бластных клеток в костном мозге. При исследовании состояния гуморального звена иммунной системы обнаружено, что на стадии первичной атаки никаких отклонений от нормы нет. При ремиссии заболевания установлено выраженное снижение концентрации IgA и IgG. При рецидиве ОЛЛ сохранялось понижение в содержании IgA, до уровня нормы восстанавливаkся уровень IgG в сыворотке крови, и понижалась концентрация IgM. При исследовании состояния метаболического статуса лимфоцитов крови у больных ОЛЛ с первичной атакой снижена активность Г3ФДГ, которая определяла пониженный уровень переноса продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза. Сниженный уровень гликолиза в лимфоцитах характеризовался понижением активности анаэробной реакции ЛДГ. Ингибирование ферментативных реакций гликолиза в лимфоцитах крови больных осуществлялось на терминальных реакциях (понижен уровень активности НАДН-ЛДГ). Пониженные уровни активности НАДИЦДГ и МДГ отражали снижение интенсивности субстратного потока по лимонному циклу у больных с первичной атакой. Недостаточность метаболических реакций митохондриального компартмента определялась снижением активности вспомогательных дегидрогеназных реакций (НАДФИЦДГ) и нарушением взаимосвязей между реакциями цикла Кребса и процессами аминокислотного обмена (понижение активности НАДГДГ). У больных в стадии ремиссии ОЛЛ дополнительно к нарушениям в циклах Кребса и лимонном цикле присоединялось снижение перекисных процессов в лимфоцитах, так как наблюдалось снижение активности ГР. У больных при повторном рецидиве ОЛЛ дополнительно к изменениям больных при ремиссии выявлялся пониженный уровень активности Г3ФДГ. Подобное состояние реакций приводило к ингибированию гликолиза, что подтверждалось сниженной активностью анаэробной реакции ЛДГ. Ингибирование ферментативных реакций гликолиза в лимфоцитах крови больных осуществлялось на терминальных реакциях (понижены уровни активности НАДН-ЛДГ и НАДН-МДГ). В лимфоцитах крови активность аэробной реакции ЛДГ снижена, в результате этого в митохондриальный компартмент поступало пониженное количество пирувата, что, приводило к ингибированию ферментативных реакций цикла трикарбоновых кислот. Пониженные уровни активности НАДИЦДГ и МДГ отражали снижение интенсивности субстратного потока по лимонному циклу. Недостаточность метаболических реакций митохондриального компартмента также определялась понижением активности вспомогательной дегидрогеназной реакции (НАДФИЦДГ) и нарушением взаимосвязей между реакциями цикла Кребса и процессами аминокислотного обмена (понижена активность НАДН-ГДГ). Сниженная активность ГР отражала понижение перекисных процессов в клетках крови у больных ОЛЛ в стадии рецидива. Таким образом, на всех стадиях ОЛЛ у больных развивался Т-клеточный иммунодефицит. Снижение Т- лимфоцитов и уменьшение величины иммунорегуляторного индекса способствовало появлению первичной атаки ОЛЛ. Особенностью рецидива ОЛЛ являлось увеличение содержания NK- клеток. На всех стадиях ОЛЛ наблюдалось выраженное уменьшение интенсивности внутриклеточных метаболических процессов лимфоцитов, снижались митохондриальный транспорт, гликолиз, метаболизм лимонной кислоты. Особенностью атаки ОЛЛ являлись нормальные перекисные процессы в лимфоцитах, снижался внутриклеточный липидный катаболизм и увеличивалось переаминирование. На стадиях ремиссии и рецидива – снижались перекисные процессы в лимфоцитах. Дополнительно при рецидиве – снижался внутриклеточный липидный катаболизм, и нарушались взаимосвязи цикла Кребса с аминокислотным обменом. Успехи химиотерапии, достигнутые в последние годы, позволяют добиться полной ремиссии у страдающих ОЛ. Так, по данным литературы, при использовании современных цитостатических протоколов у 70-93% взрослых пациентов и у 85-100% детей ОЛЛ удаётся достичь полной ремиссии. Однако у 60-80% больных с полной ремиссии развивается рецидив заболевания, который обусловлен резистентностью лейкозного клона к проводимой химиотерапии, развитием вторичной резистентности бластных клеток к лечению, ухудшением клинического течения заболевания, развитием осложнений от самого лейкозного процесса и химиотерапии. Принципиальное значение для эффективного лечения ОЛ имеет программное лечение, то есть проведение поэтапной полихимиотерапии с соблюдением доз и интервалов введения химиопрепаратов. Использование поэтапной химиотерапии, ростовых факторов позволяет сокращать период постцитостатического агранулоцитоза и за счет этого уменьшить частоту инфекционных осложнений. Клетки иммунной системы, осуществляющие функции фагоцитоза и элиминации чужеродных агентов, участвующие в воспалении и уменьшающие или предотвращающие развитие инфекционных осложнений являются нейтрофильные гранулоциты. В связи с этим, мы изучили особенности функционирования нейтрофильных гранулоцитов после химиотерапии у больных ОЛЛ. Функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов меняется у больных ОЛЛ по мере прогрессирования заболевания, и если на стадии первичной атаки отмечается усиление активности, то на стадиях полной ремиссии и повторного рецидива регистрировалось снижение функциональной активности. Неблагоприятность исходов больных ОЛ во многом обусловлена появлением инфекционных и геморрагических осложнений после проведения химиотерапии. Данный вид осложнений возникает у больных ОЛ вне зависимости от вида заболевания и стадии, значительно ухудшает качество их жизни и отрицательно влияет на исход болезни. Учитывая полученные нами данные, мы предлагаем новые способы прогнозирования инфекционных и геморрагических осложнений после химиотерапии у данной категории больных. В настоящее время не вызывает сомнений факт, что наиболее ранние признаки нарушений, следует искать на уровне клетки, где начинается формирование ответной реакции на онковоздействие. Наиболее информативными показателями внутриклеточного метаболизма являются дегидрогеназы. Это позволяет использовать их в качестве показателей, характеризующих метаболическое состояние лимфоцитов у больных ОЛ в прогнозе инфекционных и геморрагических осложнений после химиотерапии. Сущность способа заключается в исследовании активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных ОЛ (Г6ФДГ, НАДФМДГ и/или НАДФГДГ) до проведения химиотерапии. О возможности возникновения инфекционных и геморрагических осложнений у больных судят по сочетанию величин активности двух дегидрогеназ в лимфоцитах крови. При сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 32,74 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 8,29 до 15,37 мкЕ прогнозировалось развитие инфекционных осложнений у больных ОЛ после химиотерапии, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФМДГ в пределах от 0,01 до 3,21 мкЕ прогнозировалось отсутствие осложнений. При сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 10,02 до 66,51 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 84,27 до 257,39 мкЕ прогнозировалось развитие геморрагических осложнений, а при сочетании активности Г6ФДГ в пределах от 0,01 до 4,45 мкЕ и НАДФГДГ в пределах от 0,01 до 52,86 мкЕ прогнозировалось отсутствие геморрагических осложнений. Чувствительность тестов составила 0,96-0,97. Патенты RU 2315305 C2, RU 2324190 C2. Таким образом, проведенное нами исследование подтвердило, что при ОЛЛ значительно меняется функциональное и метаболическое состояние лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов по мере прогрессирования заболевания, которое вероятно является ответственным не только за возникновение осложнений, но и обуславливает возникновение повторного рецидива и ухудшает прогноз заболевания в целом. ACUTE LYMPHOBLAST LEUKEMIA: FEATURES OF LYMPHOCYTES AND NEUTROPHIL GRANULOCYTES FUNCTIONING V. Manchuk, O. Smirnova Research institute of medical problems of the North of the Siberian Department of the Russian Academy of Medical Science, Krasnoyarsk, Russia Authors carry out the analysis of disease and structure of acute leukemia in Krasnoyarsk and Krasnoyarsk region during 2000 – 2005 years. The features of functioning of immune system cells of patients with acute lymphoblastic leukemia depending on the disease stage were also revealed. Authors offer a new way of prognosis of infectious and hemorrhagic complications after chemotherapy in the given patient category. ЭВОЛЮЦИОННАЯ РОЛЬ РЕТРОВИРУСОВ, ФУНКЦИИ ПЛАЦЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ Киселев О.И. ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ, С–Петербург Открытие эндогенных ретровирусов относится к одним из фундаментальных открытий ХХ столетия. В СССР эти открытия связаны с именами таких исследователей, как В.М. Жданов и Б.А. Лапин. Уже в ХХI веке были расшифрованы геномы человека и шимпанзе. Сравнительный анализ геномов позволил установить, что более 20% генома человека и обезьян составляют последовательности эндогенных ретровирусов. Этот парадокс в настоящее время находит свое понимание при глубоком анализе инфекционной патологии человека. В период пандемии гриппа 2009/10 беременные женщины относились к наиболее приоритетным группам риска, так как у беременных заболевание гриппом чаще протекает в тяжелой форме, а выбор средств лечения крайне ограничен. «Синдром беременных женщин при гриппе» следует квалифицировать, как развитие инфекционного процесса на фоне острой иммуносупрессии, когда физиологическая иммуносупрессия, связанная с беременностью, накладывается на воздействие вирусов на иммунную систему. Более того, молниеносное течение в некоторых случаях гриппа у беременных женщин напоминает по клинической картине и состоянию иммунной системы геморрагическую лихорадку Эбола, характеризующуюся особыми механизмами подавления иммунной системы хозяина. Концепция иммуносупрессии у беременных женщин основана на понимании механизмов генерализации иммуносупрессии, сопутствующей беременности в связи с экспрессией иммуносупрессивных элементов эндогенных ретровирусов плаценты. На рисунке 1 представлена экспрессия эндогенных ретровирусов в тканях животных и человека. Рис. 1. Эспрессия эндогенного ретровируса HERV в тканях человека. Как видно из рисунка 1, высокий уровень экспрессии эндогенного вируса HERV наблюдается только в плаценте. В большинстве других тканей уровень экспрессии носит пороговый (базисный) характер или просто отсутствует. Структура генома ретровируса HERV включает в себя гены gag, pol и env (рис.2). Все гены необходимы для репликации (pol), образования вирусных частиц – капсидации (gag) и образования белково–липидной оболочки (env). LTR – длинные концевые повторы необходимы для интеграции и реинтеграции (рис.2). Белок env получил название синцитина за его способность к образованию синцития. Суть этого процесса сводится к слиянию моноядерных клеток в крупные трофобластные синцитиальные – многоядерные. При ограничении образования синцитиальных структур происходит нарушение развития плаценты и возникает невозможность вынашивания плода. Таким образом, в процессе развития плаценты происходит полноценная экспрессия ретровируса HERV, обеспечивающая морфогенез плаценты, что одновременно сопровождается образованием интрацистернальных вирусных частиц (см. рис. 2). Рис.2 Генетическая структура (карта) эндогенного ретровируса человека (HERV) с указанием длинных концевых повторов (LTR) и генов, кодирующих белки gag, pol, env (а). На карте белка выделены домены поверхностной (ЭД) и трансдермальной (ТМ) частей. В пределах трансдермальной части (ТД) выделены FP - пептид слияния (фьюжин), ISD - иммуносупрессивный домен (ИСД), TDM - трансмембранный домен, ориентирующий белок env - в мембране. Справа на рис. 2б представлен морфогенез синцитиотрофобласта и локализация эндогенных вирусных частиц. Белок env ретровируса HERV обладает фьюзогенными и синцитий – образующими функциями, необходимыми для образования синцитиотрофобластов. По центру трансмембранной части локализуется так называемый иммуносупрессивный домен (ИСД). Впервые этот домен идентифицирован в виде пептида CSK-17 у эндогенных ретровирусов. Сердцевинный – коровый домен этого белка отличается высокой гидрофобностью и обогащен остатками Лейцина и представлен гексапептидом LDLLFL, который в большинстве случаев фланкирован положительно заряженными аминокислотными остатками. Такая же закономерность выявляется при сравнительном анализе ИСД – последовательностей ретровирусов животных и человека. На рисунке 3 представлены структуры ИСД ретровирусов в сравнении с пептидом CSK-17. FeLVp15E QNRRGLDILFLQEGGL HTLV-1/2gp21eE QNRRGLDILFLQEGGL ERV3 Env QNRLALDYLLAQEEGV HERV-W Env LQNRRALDLLTAERGGL * CSK-17 LQNRRGLDLLFLKEGGL Рис. 3. Первичная структура иммуносупрессивных доменов ретровирусов животных и человека. Сравнительный анализ структуры ИСД доменов у более обширных групп вирусов показал, что подобные домены свойственны многим вирусам животных и человека, а у вируса ВИЧ-1 данный домен локализуется в непосредственной близости от пептида слияния – фактора инвазивности вируса, определяющего способность к эффективному инфицированию клеток [1]. При этом в работе Сигалова [2] представлены принципиально новые механизмы действия, как пептидов слияния, так и ближайших к ним доменов, известных как ИСД. Согласно данным этой работы, ИСД как фьюзогенные пептиды, так и пептиды типа ИСД могут проявлять иммуномодулирующие функции. Иммуномодуляция в этом случае может осуществляться путем трансмембранного взаимодействия с трансмембранными доменами TCR?–рецепторов, являющимися ключевыми факторами активации Т–лимфоцитов [1,2]. Действительно, фъюжин пептиды ВИЧ-1 gp41 обладают прямым действием на активацию Т–лимфоцитов, эффективно подавляя их функции в условиях действия антигенного стимула [1]. Этот уникальный механизм действия вирус–специфических пептидов обрывает на самом начальном этапе реакцию Т–лимфоцитов на вирусные и другие антигены и блокирует распознавание чужеродных антигенов в организме. Этот механизм действия быстро реализуется в условиях активной репродукции и диссеминации вируса в организме. Данные по высокому уровню экспрессии эндогенных ретровирусов с мощными иммуносупрессивными механизмами настолько очевидны, что вряд ли особенности женского организма при беременности следует относить только к изменениям гормонального фона. Действие иммуносупрессивных доменов направлено на блокаду презентации антигенов плода иммунной системой материнского организма. Установлено, что синтетические иммуносупрессивные пептиды и соответствующие им белковые домены блокируют активацию и пролиферацию Т–лимфоцитов через TCR?–рецепторы. С другой стороны, согласно нашим исследованиям, эти пептиды способны блокировать «карман» HLA–антигенов, что также делает невозможным взаимодействие с другими антигенами. Фактически, эти механизмы предупреждают возможность презентации антигенов плода иммунной системой материнского организма, что, фактически, и обеспечивает вынашивание плода и является важнейшей функцией плаценты. Дополнительный вклад вирусов в функциональную иммуносупрессию при беременности приводит к подавлению неспецифического и специфического иммунного ответа у беременных. Понимание природы этого явления позволяет предпринимать усилия по разработке средств обеспечивающих защиту от инфекционных заболеваний [3, 4]. Средства инактивации иммуносупрессии, вызванной инфекционными агентами могут быть разработаны на основе комплементарных пептидов или лигандов, препятствующих их взаимодействию с компонентами иммунной системы. Понимание роли и механизмов действия эндогенных ретровирусов на иммунитет при беременности позволяет надеяться на возможность управления этими процессами при развитии острых иммуносупрессивных состояний у беременных женщин в случае заражения патогенными вирусами, в том числе пандемическими вирусами гриппа. 1. Bloch I, Quintana FJ, Gerber D, Cohen T, Cohen IR, et al. T-Cell inactivation and immunosuppressive activity induced by HIV gp41 via novel interacting motif. Faseb J. 2007, V 21, p.393–401. 2. Sigalov A.B. Novel Mechanistic Insights into Viral Modulation of Immune Receptor Signaling. PLoS Pathog. 2009, V. 5(7), e1000404. doi:10.1371/journal.ppat.1000404 3. Palacios G. , Yaddanapudi K., Lipkin I. Filoviral immunosuppressive peptides and uses thereof . USPTO 20070185025 - Class: 514012000 (USPTO). 4. Yaddanapudi,K., Palacios,G., Towner,J.S., Chen,I., Sariol,C.A., Nichol S.T., Lipkin,W.I. Implication of aretrovirus-like glycoprotein peptide in the immunopathogenesis of Ebola and Marburg viruses. FASEBJ. 2006, V. 20, p. 2519–2530. МИКРОБИОЦЕНОЗНАЯ МОДЕЛЬ «ПАТОГЕН – ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ЛЕКТИНЫ» ДЛЯ МОНИТОРИНГА ДИСБИОЗА БИОТОПОВ ПРИМАТОВ Лахтин М.В., Байракова А.Л., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Москва, Россия Введение. Вопросы приматологии неизбежно включают рассмотрение инфекционного процесса с участием микробиоценозов организма, в нормальном функционировании которых ключевая роль отводится нормофлоре, представленной, главным образом, лактобациллами и бифидобактериями. Разработка пробиотических препаратов и лекарственных форм имеет стратегическое значение [1, 2]. Эволюционная близость человека и обезьян проявляется и в использовании организмом идентичных и таксономически близких видов нормофлоры. Очевидно, что любые разработки в области пробиотиков, сделанные на объектах организма человека, могут найти применение и для других приматов. Нами впервые выделены и стандартизированы наборы лектинов (углеводы/гликоконъюгаты-распознающих белков) производственных штаммов пробиотических лактобацилл и бифидобактерий человека, обладающие выраженным действием против возбудителей болезней грибковой природы и грамположительных патогенов [2-5]. Нами показано, что кандиды (например, изолированные из прямокишечного биотопа человека) обладают сенсорной чувствительностью к присутствию лектинов лактобацилл (ЛЛ) и, особенно, лектинов бифидобактерий (ЛБ), проявляющих свойства пробиотиков (имитирующих их действия). Таким образом, взаимодействие пробиотических лектинов (ПЛ) с клиническими штаммами кандид (КШК) является не только естественным защитным, но и отражает более сложное функционирование эндогенной микробиоценозной системы организма. Кандиды обнаруживаются во многих биотопах пациентов и здоровых людей. Являясь, как и организм хозяина, эукариотическим, и обладая способностью к прямым взаимодействиям с различными бактериями окружающего микробиоценоза, кандиды представляют собой объект универсальной коммуникации с хозяином и микробиотой. Мы предположили, что клинические штаммы кандид, выделенные из биотопов, отражают особенности дисбиотического статуса биотопов с нарушенным балансом микрофлоры, которые могут быть выявлены через взаимодействия клинических штаммов с стандартизированным набором препаратов ПЛ. Цель – исследовать взаимодействие ПЛ и КШК урогенитальных биотопов с охарактеризованным микробиоценозом. Материалы и методы. Использовали собственные препараты (фосфо)маннан- и муцин-распознающих ПЛ (кислых ЛЛ и ЛБ). Изоляцию, идентификацию микроорганизмов в соскобах, расчет лейкоцитов в мазках проводили стандартными методами [7]. Влияние субгемагглютинирующих концентраций ЛЛ и ЛБ на суспензионные культуры КШК изучали в физиологическом растворе, на протяжении трех суток инкубации при 37оС в микропанели при перемешивании. Предварительно суспензии доводили до значений 0.5 или 1.0 по стандартам мутности по МакФаррелу. Изменения оптической плотности суспензий кандид в процессе инкубации с ПЛ и в контролях (без ПЛ) регистрировали на ридере (600 нм). Результаты. Антикандидозное действие ПЛ возрастало по мере увеличения времени контакта ПЛ с КШК. Оно было штамм- и видзависимым (табл. 1). Максимальные ПЛ-зависимые различия между КШК наблюдались через сутки инкубации, все еще были выражены через 2 суток для ряда штаммов, а через 3 суток появлялось или усиливалось сходство антикандидозного эффекта ПЛ в отношении некоторых других штаммов. Через сутки совместной инкубации взаимодействие ПЛ (ЛБ > ЛЛ) с С. kruseus было более выражено по сравнению с С. tropicalis (p < 0.05). Выраженность взаимодействия ЛБ и ЛЛ с КШК выявлялась на этапе до развития воспаления в биотопах (количество лейкоцитов в мазках было все еще в пределах нормы), коррелировала с недостатком бифидобактерий и лактобацилл в биотопах и особенно проявлялась в случаях цервицита, кольпита, бактериального вагиноза и кандидозного вагинита при сравнении с биотопами здоровых доноров (табл. 2). Выводы. Результаты указывают на перспективы: а) антикандидозного и антидисбиотического действия ПЛ, направленного на восстановление нормофлоры в биотопе; б) использования изолированных КШК как биомаркеров дисбиоза содержащих кандиды биотопов, а панели ПЛ - для ранней диагностики особенностей дисбиозов (в том числе для подтверждения диагноза), мониторинга сброса антигенов с поверхности патогенов и продуцирования патогенами гидролаз [8] в более поздние сроки развития культур патогена. Табл. 1. Вид-зависимое взаимодействие пробиотических лектинов с суспензиями С.tropicalis (I) и С.krusei (II). Лектины, Разведения, Вид кандид Кислые лектины бифидобактерий Сутки Двое суток Кислые лектины лактобацилл Сутки Двое суток 1:10, I 36.43±4.50(7)* 67.14±8.41(7)* 34.60±2.51(5)* 64.43±12.11(7)* II 31.57±2.94(7)* 96.43±18.89(7)* 26.60±0.89(5)* 38.00± 8.48(7)* К 54.12±7.08(8) 62.12±7.68(8) 43.62±40.23(8) 60.12±52.17(8) 1:100, I 37.38±2.07(8)* 72.87± 7.36(8) 35.75±4.17(8) 52.86±14.18(7)* II 33.50±2.98(8)* 80.75±21.40(8) 35.00±0.76(8) 39.00±1.85(7)* К 58.37±6.23(8) 69.00± 9.40(8) 34.50±1.41(8) 42.86±12.70(8) 1:1000, I 36.63±2.92(8)* 61.87±3.98(8)* 36.88±2.95(8)* 63.75± 6.36(8)* II 25.00±1.60(8)* 46.12±3.91(8)* 33.25±1.39(8)* 38.00±1.85(8)* К 37.87±1.88(8) 43.50±2.62(8) 33.50±1.51(8) 42.88±14.77(8) 1:10000, I 39.38±3.74(8)* 67.75±8.55(8)* 35.62±2.56(8) 71.17±8.77(6)* II 25.86±2.79(7)* 40.37±6.48(8)* 35.00±1.93(8) 39.37±2.87(8)* К 41.25±26.03(8) 45.37±24.87(8) 35.37±1.77(8) 44.75±13.62(8) Примечание. Даны значения D600 х10-3 (в скобках – число сравниваемых штаммов). Инкубации клеточных суспензий 107 КОЕ/мл в физиологическом растворе при 37оС. *Различие I и II статистически достоверны (р<0.05) для выбранных времени инкубации и разбавления лектинов. К - контроль (без лектинов). Табл. 2. Взаимодействие лектинов лактобацилл и бифидобактерий (ЛЛ, ЛБ) с суспензиями клеток клинических штаммов Сandida tropicalis урогенитальных биотопов пациентов и здоровых доноров. №№ Диагноз Характеристика биотопа Взаимодействие с лектинами 4 Хронический кандидоз Candida 106, нет лактоба- бацилл и бифидобактерий ЛБ-сходство с 73**. 42 Хронический бактериальный вагиноз Candida 106, нет лактоба-цилл и бифидобактерий; Лц 20-25 ЛЛ-сходство с 73** 73 Хронический вагиноз Candida 5х104, лактобациллы >105, нет бифидобактерий; Лц 10-15 ЛБ-сходство с 4**,633***; ЛЛ-сходство с 42**,633***; С.krusei 584**, 687** 633 Хронические кандидоз и кольпит Candida 105, лактобациллы>104, нет бифидобактерий; Лц 10-15 ЛБ+ЛЛ2+ , ЛБ-сходство с 73***, ЛЛ-сходство с 73*** 665 Цервицит, аднексит Candida 5х104, лактобациллы >104, нет бифидобактерий ЛБ2+ЛЛ+, ЛБ-сходство с 738*** 738 Цервицит, Хронический кольпит Candida 5х104, лактобациллы >104, нет бифидобактерий; Лц 8-10 ЛБ3+ЛЛ-, ЛБ-сходство с 665*** 105 Здоров (плановое обследование) Candida 104 лактобациллы >105, бифидобактерии 103; половых инфекций нет; лейкоциты 2-4 Нет ЛБ/ЛЛ-сходства c клиническими штаммами 138 Нормальная беременность Candida 105, лактобациллы >106, бифидобактерии 103 Нет ЛБ/ЛЛ-сходства c клиническими штаммами Через 1-2 суток (**1 сутки, ***3 суток) инкубации кандид 107 с лектинами в разведениях 10, 100,1000,10000 раз. Норма: лактобациллы > 103, бифидобактерии < 105, лейкоциты (Лц): 10-15. Литература 1. Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В., Лахтин М.В., Воропаева Е.А., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В. Стратегические аспекты конструирования пробиотиков будущего // Вестник РАМН. - 2008. - № 2. - С. 33 - 44. 2. Лахтин М.В., Алешкин В.А., Лахтин В.М., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Роль лектинов пробиотических микроорганизмов в жизнеобеспечении макроорганизма // Вестник РАМН. - 2010. - № 2. - С. 3 - 8. 3. Lakhtin M.V., Alyoshkin V.A., Lakhtin V.M., Afanasyev S.S., Pozhalostina L.V., Pospelova V.V. Probiotic lactobacillus and bifidobacterial lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: new class of pathogen biofilm destructors // Probiotics & Antimicro. Prot. – 2010. - V. 2. – P. 186 - 196. 4. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Пожалостина Л.В., Поспелова В.В., Корсун В.Ф. Фито- и пробиотические лектины – синергичные антипатогены // Практ. фитотер. - 2010. - № 1. - C. 5 - 11. 5. Лахтин М.В., Байракова А.Л., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Корсун В.Ф. Пролонгированное антимикотическое действие пробиотических лектинов в условиях совместного культивирования с клиническими изолятами // Практ. фитотер. – 2010. - № 4. – С.40-49. 6. Лахтин М.В, Байракова А.Л., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Корсун В.Ф. Пробиотические лектины человека в защите от дисбиозов в различных биотопах человека // Практ. фитотер. - 2011. - № 1. – С. 4 - 13. 7. Байракова А. Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе // Автореф. дис. к.б.н. – М., 2010. – 24 с. 8. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Алешкин А.В. Лектины и ферменты в биологии и медицине. - Москва: Издательство «Династия», 2010. – 496 с. MICROBIOCENOSIS MODEL “PATHOGEN – PROBIOTIC LECTINS” FOR MONITORING PRIMATE BIOTOPE DISBIOSES M. Lakhtin, A. Bajrakova, V. Lakhtin, A. Alyoshkin, S. Afanasyev, V. Alyoshkin G.N.Gabrichevsky Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia Organism biotopes containing Candida and decreased levels of normoflora were studied. The high sensitive model system (probiotic bacterial lectins - Candida clinical strains) was proposed for monitoring of biotope disbioses. It was shown that the panel of lectins of human probiotic lactobacillus and bifidobacterial industrial strains discriminates cultures of Candida species and strains, characterizes disbioses of urogenital biotopes before inflammation, and suppresses pathogen development and growth. It was concluded that probiotic lectins are perspective for restoring healthy microbiocenoses in biotopes оf organisms including primates. Key words: probiotics, probiotic lectins, Candida, anti-pathogens, biotopes, microbiocenoses, disbioses. НELICOBACTER РYLORI У ОБЕЗЬЯН: ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ. Калашникова В.А. НИИ МП РАМН, г. Сочи-А, Россия. Инфекции, вызванные Helicobacter pylori, - одни из распространённых бактериальных инфекций у людей. Микробы колонизируют слизистую желудка и ведут к пожизненной инфекции. Существуют предположения о ведущем значении в развитии желудочно-кишечных заболеваний внутривидового разнообразия штаммов H.pylori, степени обсеменённости этими бактериями слизистой оболочки желудка, генетической предрасположенности, характера иммунного ответа. В последние годы учёные занимаются исследованием факторов вирулентности штаммов H.pylori. Наиболее известные из них – вакуолизирующий цитотоксин (продукт гена vacА) и маркер «островка патогенности» критический иммунодоминантный белок CagA, кодируемый цитотоксин-ассоциированным геном cagA. По наличию этих генов штаммы делятся на группы: тип I – CagA+ и VacA+, который включает Ia (CagA+ и VacA–) и Ib (CagA– и VacA+); тип II - cagA– и vacA–. Отмечена чёткая связь между типами штаммов и их географическим происхождением, если тип I обычно выделяют в Европе, США, Австралии, то тип II – в Юго-Восточной Азии. Однако, если вопросы, посвящённые проблеме хеликобактерной инфекции у людей, в настоящее время широко освещены в литературе, то сведений по инфицированности обезьян различных видов H.pylori относительно немного в иностранной литературе. Целью работы явилось изучение распространения H.pylori и генов их вирулентности, обнаруженных у обезьян. Материалы и методы. Обследовано 126 погибших обезьян (макаки резусы-57, макаки яванские-16, макаки лапундеры-3, макаки ассамские-1, мартышки зелёные-8, павианы анубисы-9, павианы гамадрилы-31, саймири-1), из которых без поражения желудка была 81 особь, с поражением желудка–45 (преимущественные диагнозами: гастроэнтероколиты–30, гастроэнтериты–5, безоар желудка–1, острое расширение желудка–1, гастриты–8). Для исследования брали кусочки желудка и двенадцатиперстной кишки. Генотипирование H.pylori проводилось с использованием коммерческих наборов «Хеликопол», «Хеликопол СА», «Хеликопол VA», «Хеликопол ВА» и «Хеликопол IA», произведённых НПФ «Литех». Определяли наличие генов ureC (предиктора инфекции), cagA (маркера «островка патогенности»), полиморфизм гена vacA (вакуолизирующего цитотоксина) по сигнальному и среднему участку (подтипы s1/s2, m1/m2 соответственно), iceA (аллельные формы A1 и A2) и babA. ПЦР-анализы ставились согласно инструкции, амплификация шла в режиме последовательно связанных программ. Результаты ПЦР регистрировали с помощью видиосистемы гельдокументации «Gel Imagen» («ДНК-технология»). Результаты и обсуждение. Верифицированные непосредственно в образцах желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью ПЦР H.pylori (n = 69) были проанализированы на одновременное присутствие генотипов ureC, vacA, cagA, iceA1A2 и babA. VacA – мозаичность определяли как генотипы s1/s2 и m1/m2 H.pylori. В результате исследования выявлено 69,3% уреазоположительных и 30,7% уреазоотрицательных H.pylori. В 17,2% случаев нами был зарегистрирован маркер «островка патогенности» cagA. Генотип вакуолизирующего цитотоксина vacA обнаружен в 27,2%. На одновременное присутствие аллельных вариантов vacA, iceА1A2, babA был исследован материал от 35 обезьян с патологией ЖКТ. При этом сигнальный регион vacA в аллельном варианте s1 - vacAs1 H.pylori был выявлен в 48,6% образцов, а аллельный вариант s2 - vacAs2 – 42,9%. Также обнаружили и смешенный генотип H.pylori: 34,3% образцов соответствовали генотипу vacAs1/s2, а 2,9% - соответствовали генотипу vacAm1/m2. Вариант m1 среднего региона - vacAm1 верифицирован в 20%, а вариант m2 - vacAm2 – 28,6% случаев. В 3 образцах отмечено присутствие только одного генотипа vacAm2. Нам удалось выявить iceA2 как отдельный генотип, а также в сочетании с генотипом iceA1 (17,2 и 11,4% соответственно). Ген babA верифицирован у H.pylori при исследовании материала в 2 образцах (5,7%). Нами были также выявлены комбинации генотипов vacA s- и m- регионов, cagA, iceA H.pylori. Ген iceA находился в сочетании с cagA. Сочетание аллельных вариантов двух вариабельных участков гена vacA отмечено в 8 образцах, при этом vacAs1/s2m1 – обнаружен в 4 образцах, vacAs1/s2m2 – в 3, в одном случае наблюдалось сочетание vacAs2m1/m2. Исследование одновременного присутствия в 35 образцах генотипов cagA, vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 H.pylori показало, что при cagA-положительном генотипе H.pylori 10 из 35 образцов имели vacAs1 – генотип, 8 - vacAs2, 6 - vacAm1 и 4 - vacAm2. Генотипы H.pylori s1/m1, s1/m2, s2/m1 vacA имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина и, соответственно, обладают наибольшей цитотоксичностью, H.pylori с генотипом s2/m2 проявляют незначительную цитотоксическую активность. Так как геном H.pylori содержит только одну копию гена вакуолизирующего цитотоксина, регистрация смешенных генотипов свидетельствует о присутствии более одного штамма данного микроба в исследуемом патологическом материале. Результаты изучения генотипов вирулентности H.pylori, обнаруженных в желудке и двенадцатиперстной кишке погибших обезьян, представлены в таблице 1. Как видно из таблицы, в исследованном материале чаще верифицированы гены ureC, cagA, vacAs2. Генотипы вакуолизирующего цитотоксина vacAs1 и vacAs2 H.pylori приблизительно с одинаковой частотой встречаются как в желудке, так и в двенадцатиперстной кишке. Генотипы vacAm1 H.pylori немного чаще удалось выявить в двенадцатиперстной кишке (19,1%), а vacAm2 – в образцах желудка (17,7%) [табл. 1]. Таблица № 1. Распределение генотипов вирулентности H.pylori в патологическом материале. Гены патогенности Исследуемый материал Желудок, n=34, % ДПК, n=21,% cagA 15 (44,1) 8 (38,1) vacAs1 10 (29,4) 6 (28,6) vacAs2 11 (32,4) 7 (33,3) vacAm1 4 (11,8) 4 (19,1) vacAm2 6 (17,7) 2 (9,5) babA 1 (3,0) 1 (4,8) iceA1 3 (8,8) 1 (4,8) iceA2 2 (5,9) 3 (14,3) ureC 13 (38,2) 9 (42,9) При исследовании положительных на H.pylori образцов желудка и двенадцатиперстной кишки погибших от ЖКЗ обезьян (гастриты–8, гастроэнтероколиты–21), удалось типировать H.pylori по факторам вирулентности cagA и vacAs1/s2 vacAm1/m2. При гастритах, в основном, превалировало сочетание генотипов cagA vacAs1/s2m2, в то время, как при гастроэнтероколитах - cagAvacAs1/s2m1. Было установлено, что у больных ЖКЗ обезьян, гены, кодирующие синтез наиболее агрессивных факторов вирулентности H.pylori, встречались немного чаще в сочетании по 2 или 3 гена (53%), чем у H.pylori, обнаруженных в материале погибших обезьян без поражения желудка (в основном при кишечных заболеваниях) – 42%. Анализ верификации генов вирулентности и их комбинаций позволил установить типы H.pylori, циркулирующие среди обезьян. Так же, как и у людей, у обезьян обнаружены 2 типа хеликобактерий. В большинстве изученных проб H.pylori были представлены вирулентными представителями I типа (59%). H.pylori II типа обнаружены несколько реже – в 41%. В 11,4% случаев одновременно определены вирулентные бактерии I и II типов. Частота встречаемости типов H.pylori у разных родов обезьян представлена в таблице 2. Из 8 штаммов H.pylori, обнаруженных у мартышек, 4 отнесли к типу Ib, а 4 – ко II типу. Замечено, что H.pylori Ia типа чаще выявлялись у павианов, а Ib – у макаков. Таблица № 2. Частота обнаружения типов H.pylori у разных родов обезьян. Вид 1 тип, абс.число / % 1а тип, абс.число / % 1в тип, абс.число / % 2 тип, абс.число / % Павианы 6/10 17/28,3 9/15 28/46,7 Макаки 15/20,8 7/9,7 24/33,3 26/36,2 Мартышки - - 4/ 4/ Всего 21/16 24/18 33/25 54/41 Таким образом, не выявлено каких-либо значимых ассоциаций между vacA генотипом и конкретным заболеванием. Несмотря на достаточно высокий процент обнаружения ДНК H.pylori, в период обследования у обезьян не отмечены случаи дуоденальных язв и опухолей желудка. Не удалось зарегистрировать каких-либо строгих ассоциаций между выявленными генотипами H.pylori и видами обезьян. Можно предполагать, что распределение генотипов H.pylori у разных видов обезьян имеет, скорее всего, случайный характер. Определённая сложность изучаемой проблемы связана со значительными различиями генетической структуры бактерий в различных популяциях мира. Поэтому вопрос о вирулентной комбинации CagA и VacA генотипов H.pylori у обезьян и людей нуждается в дальнейшем изучении. Выводы. 1. У обезьян высока частота распространения H.pylori II типа, не обладающих генами, кодирующими агрессивные факторы вирулентности. 2. Уреазоположительные H.pylori обнаружены в 2 раза чаще, чем уреазоотрицательные. 3. Частота верификации гена вакуолизирующего цитотоксина H.pylori выше, чем «островка патогенности». 4. Выявлены различия в распределении аллельного варианта среднего региона гена вакуолизирующего токсина. 5. Наиболее часто в желудке и двенадцатиперстной кишке обезьян встречались хеликобактерии с генотипом vacAs2 и vacAm2. 6. У больных ЖКЗ обезьян, гены, кодирующие синтез наиболее агрессивных факторов вирулентности H.pylori, встречались немного чаще в сочетании по 2 или 3 гена, чем у H.pylori, обнаруженных в материале погибших обезьян без поражения желудка (в основном при кишечных заболеваниях). 7. Обнаруженные нами vacAs2 H.pylori являются cagA-позитивными (ранее у людей была установлена строгая ассоциация генов cagA и vacAs1 H.pylori). HELICOBACTER PYLORI IN MONKEYS: GENETIC FEATURES OF MICROORGANISMS V.A. Kalashnikova Research Institute of Medical Primatology RAMS The aim of this work was to study H.pylori incidence and its virulence genes revealed in monkeys. Specimens of stomach and duodenum were taken for investigation. H.pylori genotyping was carried out using commercial kits. Presence of ureC gene (infection predictor) and cagA (“pathogenicity island” marker), polymorphism of signaling and middle regions of vacA gene (vacuolazing cytotoxin) (subtypes s1/s2, m1/m2 respectively), iceA (A1 and A2 alleles forms) and babA was detected. As a result of the investigation 69.3% ureasepositive and 30.7% ureasenegative H.pylori have been detected. In 17.2% of cases we registered cagA “pathogenicity island” marker. VacA vacuolazing cytotoxin genotype was revealed in 27.2% of cases. Specimens from 35 monkeys with gastro-intestinal diseases (GID) were investigated for simultaneous presence of vacA, iceA1/A2, babA allele variants. H.pylori s1-vacAs1 allele variant of “signal region” was detected in 48.6% of samples and s2-vacAs2 allele variant in 42.9% of cases. Mixed H.pylori genotypes were also detected: 34.4% of samples corresponded to vacAs1/s2genotype and 2.9% corresponded to vacAm1/m2 genotype. Variant m1 of the middle region (vacAm1) was verified in 20% and variant m2 (vacAm2) in 28.6% of cases. In 3 samples presence of only one vacAm2 genotype was revealed. Because H.pylori genome contains only one copy of vacuolazing cytotoxin gene, detection of mixed genotypes proves the presence of more than one strain of given microbe in pathologic material. We were able to detect iceA2 as separate genotype and also it association with iceA1 genotype (in 17.2% and 11.4% of cases, respectively). H.pylori babA gene was verified in 2 samples (5.7%). We also detected combinations of H.pylori vacA s- and m-region, cagA, iceA. IceA gene was present in association with cagA. Simultaneous presence of H.pylori cagA, vacAs1, vacAs2, vacAm1, vacAm2 genotypes in samples showed that H.pylori cagA positive genotype had vacAs1 genotype in 10 of 35 specimens; vacAs2 positive genotype was present in 8 cases, vacAm1 genotype was detected in 6 samples and vacAm2 genotype was recorded in 4 out 35 samples. H.pylori vacuolazing cytotoxin vacAs1 and vacAs2 genotypes were found with approximately equal frequencies in stomach and in duodenum. H.pylori vacAm1 genotypes were slightly more frequently found in duodenum (19.1%) and vacAm2 genotypes - in stomach samples (17.7%). In general association of cagAvacAs1/s2m2 genotypes prevailed in gastritis and cagAvacAs1/s2m1 prevailed in gastroenterocolitis. It has been established that in monkeys suffering from GID, the genes coding synthesis of H.pylori most aggressive virulence factors could be found more frequently in 2 or 3 genes association (53%) than in H.pylori from materials of deceased monkey without gastric disorders, mainly with intestinal diseases (42%). H.pylori in majority of samples was presented by virulent representatives of type 1 (59%). H. pylori type 2 was discovered more rarely (41%). Types 1 and 2 virulent bacteria were simultaneously discovered in 11,4% cases. Four of 8 H.pylori strains discovered in African green monkeys were 1b type and 4 were type 2. It was noticed that H.pylori Ia type was found more frequently in baboons and type 1b - in macaques. Despite of high percent of H.pylori DNA discovered no monkeys with duodenal ulcers or gastric tumors were found during the period of their observation. We failed to register any strict associations between H.pylori genotypes and monkey species. It can be suggested that distribution of H.pylori genotypes in different monkey species has, most likely, casual character. Definite complexity of the problem is associated with the fact that bacterial genetic structure is different in various world populations. Therefore the question of H.pylori CagA and VacA genotype virulent combination in monkeys and humans will require further research. ПОИСК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SV40 В ОПУХОЛЯХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Лапин Б.А., Чикобава М.Г., Агумава А.А., Тонконоженка О.А. ГУ НИИ МП РАМН г. Сочи Введение. SV40 (Simian virus 40 SV40) ДНК-вый онковирус, способный вызывать злокачественные новообразования у лабораторных животных. Считается, что вирус, случайным образом был внесен в популяцию людей в период с 1955- 63, через контаминированую полиовакцину [Shah K, 1976], которую получали на почках макаков резус естественно инфицированных SV40. В настоящий момент SV40 достаточно широко распространен в здоровой популяции людей в разных странах мира, и был обнаружен у людей, не подвергавшихся иммунизацией контаминированной вакциной, которая, как известно, была запрещена для производства в период с 1963- 1968гг. Широкое распространение вируса после прекращения иммунизацией контаминированной вакциной предполагает, что он способен инфицировать клетки человека, продуктивно размножается, распространяясь горизонтально в популяции людей [Лапин Б.А.]. В настоящий момент. опубликовано множество работ, в которых сообщается об обнаружении последовательностей SV40 и его антигенов при опухолевых заболеваниях у людей сходных с новообразованиями вызванными введением SV40 лабораторным животным [M. Carbone, LednickyJ.A,, Martini F., Pepper C., Brenner A.V., Cristaudo A., Vilchez R.A.,]. На основании указанных работ, ряд авторов предполагает, что SV40, является новым кандидатом и фактором риска развития онкологических заболевании человека, и предпринимаются значительные усилия для определения роли вируса в развитии заболевании. Целью настоящей работы является поиск последовательностей SV40 в новообразованиях головного мозга разных гистотипов у людей в России методом РТ- ПЦР. Материалы и методы: Материалы: Замороженные образцы опухолевой ткани были получены из Института Нейрохирургии Мозга (г. Москва). Диагностика опухолей была проведена рутинными методами. Всего было отобрано 47 образцов различных гистотипов: анапластическая олигодендрома, астроцитома, анапластическая астроцитома, анапластическая олигоастроцитома, глиобластома, глиосаркома, менингиома, атипическая менингиома, олигоденрома, лимфома, метастаз рака, метастаз рака без уточнения, эпендимома, гемобластома. (Таб.1). Выделение ДНК. ДНК экстрагировали из срезов замороженной ткани по методы [Harwood A.J.]. Несколько криостатных срезов толщиной 10мкм переносили в 1.5 мл пробирки типа Эппендорф, в раствор содержащий 200 мкг/мл протеиназы K в 200 мкл ПЦР буфера (50 мМ/ л KCI, 10 мМ/ л Tris-HCI pH 84, 1.5 мМ/л MgCl2) и инкубировали при 560C 16 часов, с последующей инактивацией фермента в течении 10-мин. при 950C. Концентрацию ДНК определяли электрофоретически. Для постановки ПЦР использовали от 1- 2 мкл экстракта. ПЦР в реальном времени (РТ ПЦР) Геном SV40 имеет до 70% гомологии с полиомавирусами человека JC и BK, инфицированность которыми достигает до 95% в популяции людей. Специфичные праймеры к участку Rb домену SV40 Taq. антигена были синтезированы на основании публикации [Susanne et. al]: (F+) 3` GGG TCT TCT ACC TTT CTC TTC TTT –5` (nt 4414-4437) и (A) 3`- GCA GTG GTG GAA TGC CTT T- 5` (по 4524-4542); внутренняя проба ТM 5`- AAC CTG TTT TGC TCA GAA GAA ATG CCA-3` (по 4488-4514) меченая FAM (6-карбоксифлуоресцин) на 5’ конце и гаситель TAMRA (6-карбокситетраметилродамин) на 3’. Синтез праймеров проводили на ЗАО Синтол, (Москва). Длина ампликона 128bp. Внутренняя проба строго специфична к SV40, так как направлена к участку с делецией в 9bp отличающую SV40 от близкородственных BKV и JCV [Regis A et al]. РТ ПЦР проводили на Bio Rad I Cycler по следующей программе: 5 мин первоначальной денатурации затем 94°C- 8сек., 60°C- 23сек., 72°C- 30сек., сек в течении 50 циклов. В качестве контроля использовали ДНК экстрагированная из крови М. rhesus. В качестве отрицательного контроля, вносили 2 мкл воды из открытой пробирки, которая находилась вместе с образцами ДНК при внесении ДНК в плашку. Иммунофлуоресценсия. Для иммунофлуоресцентной детекции Tag SV40 применяли МоАт РАВ 101 Santa Cruse USA. Криостатные срезы опухолей мозга переносили на стекло покрытое поли L лизином и фиксировали 10мин. в холодном ацетоне. Исследование проводили в непрямом иммунофлуоресцентном тесте согласно прилагаемому протоколу. Результаты исследования: Анализ ДНК экстрагированных из материалов опухолей головного мозга, методом РТ- ПЦР SV40 выявил присутствие последовательностей вируса в 9 из 24 глиобластом, 1 из 3 астроцитом, 3 из 5 анапластическая астроцитома, 1 из 2 анапластическая олигоастроцитома, 1 из 1 олигоденрома, 1 из 1 атипическая менингиома, 1 из 1 эпендимома. Результаты исследования представлены в таблице 1. Таб.1. Результаты обследования образцов опухолей мозга на выявление SV40 методом РТ- ПЦР. Пол № Диагноз Кол- во образцов SV40+ М (SV40+) Ж (SV40+) 1. глиобластома 24 9 15(4) 9(5) 2. глиосаркома 1 1 3. анапластическая олигодендрома 2 2 4. анапластическая олигодендроглиома 1 1 5. астроцитома 3 1 2 1(1) 6. анапластическая астроцитома 5 3 3(2) 2(1) 7. анапластическая олигоастроцитома 2 1 1(1) 1 8. менингиома 1 1 1(1) 9. олигодендрома 1 1 1(1) 10. лимфома 1 1 11. атипическая менингиома 1 1 1(1) 12. эпендимома 1 1 1(1) 13. гемобластома 1 1 14. олигоастроцитома 1 1 Всего 45 18 26 19 Все положительные в ПЦР SV40 случаи были обследованы МоАт РАВ 101. Результаты иммунофлуоресцентного обследования экспрессии SV40 Tag криостатных срезов опухоли мозга, выявили внутриядерную экспрессию в 3 случаях. В остальных положительных в ПЦР образцах, наблюдалось диффузное свечение. Обсуждение. Как следует из полученных нами результатов РТ- ПЦР, специфического гистотипа опухоли связанной с SV40 не выявлено. Определение вируса SV40 в разных гистотипах образцов опухолевой ткани головного мозга указывает на широкий спектр клеток, в которые вирус может инфицировать и возможно индуцировать опухолевый рост (Таб.1). По данным зарубежной литературы, последовательности SV40 были выявлены в первичной опухоли мозга в разных странах, включая Америку, Европу (Италия, Франция, Германия, а также в Азии (Тайвань, Япония, Китай). Анализ данных литературы показал, что SV40 с высокой частотой выявляется в первичных опухолях мозга. Так, SV40 был обнаружен 50- 83% choroid plexus papillomas, 60- 75% эпидимом, 32- 56% астроцитом в 37%- 59% глиобластом, 25%- олигодендром, и тд. [Martini F, 1998, Huang H]. Однако, определить, точную связь между инфицированию SV40 и ассоциацией с опухолевыми новообразованиями не просто. Носительство вируса не связано с обязательным проявлением опухолевого процесса. Как было показано ранее, высокий процент носительства наблюдается среди здоровой популяции людей в разных странах. Как в России [Лапин], так и за рубежом [Martini], последовательности вируса были обнаружены в, достаточно высоком проценте в лимфоцитах периферической крови здоровых людей. Предполагается, что латентно инфицированные SV40 лимфоциты являются вектором для проникновения вируса в другие ткани организма, и в дальнейшем необходимы другие кофакторы, способствующие опухолевому росту и прогрессии. Таким образом, можно отметить, что один из путей горизонтального распространения вируса это переливании крови, Обнаружение вируса в биологических жидкостях, указывает на существование и других путей распространения SV40 в популяции людей, со слюной, а также половым путем. Данные полученные в настоящем исследований не позволяют однозначно определить роль вируса в индукции опухолей головного мозга [Brenner A.V., Huang H]. Выявление в иммунофлуоресцентном тесте экспрессии Tag SV40 в большинстве случаев опухолей мозга, указывает на тот факт, что вирус находится в активированной форме. Для определения значения и роли вируса в индукции заболевания необходимо детальное молекулярно- биологическое исследование случаев опухоли в которых был обнаружен SV40. Однако, учитывая, что SV40 достаточно широко распространен в популяции людей, обладает онкогенными свойствами для клеток человека, был выявлен во многих независимых исследованиях в опухолях тканей мозга, то нам представляется, что ассоциация между SV40 и опухолевыми заболеваниями может считаться если не доказанной, то достаточной, чтобы привлечь к себе внимание исследователей, как новый и возможно, потенциально опасный вирус людей. Литература Лапин Б.А., Чикобава М.Г., Обнаружение SV40 в образцах крови здоровых людей в Российской Федерации. Методом RT- ПЦР. Вестник Российской Академии Медицинских Наук 2009;(4):7-10. Shah K, Nathanson N. Human exposure to SV40: review and comment. Am J Epidemiol 1976;103:1–12. LednickyJ.A,, Garcea R.L, Bergsagel D.J, Butel J.S., Natural simian virus40 strains are present in human choroid plexus and ependymoma tumors. Virology 1995;212:710–7. Martini F, Iaccheri L, Lazzarin L, Carinci P, Corallini A, Gerosa M, et al. SV40 early region and large T antigen in human brain tumors, peripheral blood cells, and sperm fluids from healthy individuals. Cancer Res 1996; 56:4820–5. Lednicky JA, Stewart AR, Jenkins JJ 3rd, Finegold MJ, Butel JS. SV40 DNA in human osteosarcomas shows sequence variation amongT-antigen genes. Int J Cancer 1997;72:791–800. Carbone M, Pass HI, Rizzo P, Marinetti M, Di Muzio M, Mew DJ, et al. Simian virus 40-like DNA sequences in human pleural mesothelioma. Oncogene 1994;9:1781–90. Pepper C, Jasani B, Navabi H, Wynford-Thomas D, Gibbs AR. Simian virus 40 large T antigen (SV40LTAg) primer specific DNA amplification in human pleural mesothelioma tissue. Thorax 1996;51:1074–6. Cristaudo A, Vivaldi A, Sensales G, Guglielmi G, Ciancia E, Elisei R, et al. Molecular biology studies on mesothelioma tumor samples: preliminary data on H-Ras, p21, and SV40. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1995;14:29–34. Carbone M, Rizzo P, Grimley PM, Procopio A, Mew DJ, Shridhar V, et al. Simian virus-40 large-T antigen binds p53 in human mesotheliomas. Nat Med 1997;3:908–12. De Luca A, Baldi A, Esposito V, Howard CM, Bagella L, Rizzo P, et al. The retinoblastoma gene family pRb/p105, p107, pRb2/p130 and simian virus-40 large T-antigen in human mesotheliomas. Nat Med 1997;3: 913–6. Vilchez RA, Madden CR, Kozinetz CA, Halvorson SJ, White ZS, Jorgensen J, et al. Association between simian virus 40 and non-Hodgkin lymphoma. Lancet 2002;359:817–23. Stewart A.R., Lednicky J.A., Butel J.S., Sequence analyses of human tumor associated SV40 DNAs and SV40 viral isolates from monkeys and humans. J Neurovirol 1998;4:182–93. Brenner A.V., Linet M.S., Selker R.G., Shapiro W.R., Black P.M., Fine H.A., Inskip P.D., Polio Vaccination and risk of brain tumors in adults: no apparent association. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2003;12:177–178. Huang H, Reis R, Yonekawa Y, Lopes JM, Kleihues P, Ohgaki H. Identification in human brain tumors of DNA sequences specific for SV40 large T antigen. Brain Pathol. 1999 Jan;9(1):43-4. Harwood A.J. Basic DNA and RNA protocols. Ed., Methods in molecular biology v.58 pp.238-239, Humana Press, Totowa, New Jersey 1996 ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЦИТОКИНОВ У ОБЕЗЬЯН, НОСИТЕЛЕЙ SV-40 Мезенцева М.В*., Агрба В.З.**, Постнов С.Е***., Карал-оглы Д.Д.**, Шаповал И.М*., Афанасьев Н.А.**, Руссу Л.И.*, Агумава А.А**., Лапин Б.А.** *ФГБУ НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва **ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Инфекция, вызываемая Simian virus (SV-40), относится к медленным инфекциям и поражает многих животных, в частности обезьян [6]. При медленных инфекциях взаимодействие вирусов с организмами имеет ряд особенностей. Несмотря на развитие патологического процесса, инкубационный период очень длительный (от 1 до 10 лет), затем при иммунодепрессии происходит развитие болезни и может наступить летальный исход. Но до настоящего времени профилактика и лечение при этом отсутствуют. Установлено, что SV-40 индуцирует одинаковые опухолевые антигены на различных тканях и у различных видов организмов. Эти антигены одинаковы для всех трансформированных клеток. В настоящее время SV-40 обнаруживается у 61% онкологических больных. И поэтому возникла теория, что этот вирус вызывает злокачественные заболевания. [12,13] В 1974 г. в лаборатории Стенли Кохена (S.Cohen) в супернатанте культивируемых клеток почки зеленой мартышки, инфицированных именно вирусом SV40, обнаружили фактор, идентичный лимфоцитарному МИФ (фактор, ингибирующий миграцию макрофагов из капилляра). С.Кохен предположил, что гуморальные факторы, секретируемые из клетки, не являются исключительной особенностью лимфоцитов и моноцитов, и предложил более универсальный термин «цитокины», который является самым точным по смыслу и на сегодняшний день [9]. Цитокины — небольшие пептидные молекулы, регулирующие межклеточные и межсистемные взаимодействия, определяющие биологические функции иммунокомпетентных клеток, а также обеспечивающие согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем в норме и в ответ на патологические воздействия. Биологический эффект цитокинов на клетки реализуется через взаимодействие со специфическими рецепторами, локализованными на клеточной цитоплазматической мембране [7]. Образование и секреция цитокинов происходит кратковременно и строго регулируется. В настоящее время известно более 30 цитокинов. Все они по структурным особенностям и биологическому действию делятся на несколько групп: провоспалительные, обеспечивающие мобилизацию воспалительного ответа (интерлейкины – ИЛ-1, -2, -6, -8, ФНО-?, ИФН-?); противовоспалительные, ограничивающие развитие воспаления (ИЛ-4, -10, TGF?); регуляторы клеточного и гуморального иммунитета (естественного или специфического), обладающие собственными эффекторными функциями (противовирусными, цитотоксическими). Спектры биологических активностей цитокинов в значительной степени перекрываются, и во многих случаях в действиях цитокинов наблюдается синергизм. Цитокины — антигеннеспецифические факторы. Специфическая диагностика инфекционных, онкологических, аутоиммунных и аллергических заболеваний с помощью определения уровня цитокинов невозможна. Но выявление нарушений в синтезе цитокинов даёт информацию о функциональной активности различных типов иммунокомпетентных клеток, о тяжести воспалительного процесса, его переходе на системный уровень и о прогнозе заболевания [5]. Согласно литературным данным, исследования цитокинового ответа при воздействии SV-40 проводились в основном in vitro на перевиваемых клеточных линиях или первично полученных от больных и инфицированных этим вирусом [8,10, 11, 13, 15-17]. При этом в разных клетках, зараженных SV-40, в различной степени отмечалась активная экспрессии генов ИЛ-1?, ИЛ-1?, ИЛ-6, ИЛ-8, GM-CSF, NF-??, ФНО-?, ИФН-? и рецепторов ряда цитокинов ИЛ-1R, ИЛ-2R (?-субъединица), ИЛ-6R, ФНО-?R (р55), ИФН-?R. Регистрировалось отсутствие экспрессии рецепторов ФНО-?R (р75), GM-CSF R. Также в инфицированных клетках были обнаружены высокие уровни GM-CSF, низкий уровень NF-?? и отсутствие ИЛ-6. Нами была поставлена задача изучить изменение экспрессии генов регуляторных цитокинов у клинически здоровых приматов и оценить на этой модели эффективность иммуномодулирующих препаратов. Материалы . Исследования проведены на 17 обезьянах макаках резус, носителях SV-40, что подтверждалось методом ПЦР. Цитокиновый профиль исследовали у 10 обезьян макаков резус. Возраст 9 обезьян составлял 4 - 5 лет. Одна обезьяна была в возрасте 12 лет. Были обследованы также 5 человек - носителей SV 40, 5 из которых получали Аводу в виде орошений ротовой полости и 2 сотрудников получали циклоферон в таблетках по схеме фирмы производителя. Для лечения обезьян были использованы препараты : циклоферон ( производства ООО «Научно- технологическая фармацевтическая фирма «ПОЛИС АН») самостоятельно и в комбинации с модифицированной Аводой ( производства ФГУП _Центральный аэродинамический институт им. Н.Е.Жуковского на основе биофизической модели живого организма) [4]. Обезьяны получали циклоферон в виде инъекций 3 раза в неделю в дозе 12,5 мг/кг и по 5 мл Аводы перорально. Курс терапии длился 2 месяца. Методы исследования Активность мРНК 11 цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови обезьян (МПК) изучали методами обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Выделение РНК проводили методом кислой гуанидин тиоционат – фенол- хлороформ экстракции. В работе были использованы пары праймеров для следующих цитокинов: ИФН-?, ИФН-?, ИЛ-1?, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8 , ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-?. В качестве положительного контроля использовали ?-актин. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega (G 1758). Для определения SV40 в ПЦР праймеры и зонд подбирали к участку Т-большого антигена вируса, длина ампликона составляла 70 оснований. Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили на аппарате Bio-Rad iCycler. Использовали следующий температурный режим: 950 С– 5 мин; далее 45 циклов: 950С – 15 с., 600С- 60 с., 100С – хранение. Учет светимости проводили при 600С после каждого цикла по FAM. Результаты и обсуждение Ранее нами были описаны нормы цитокинового профиля для клинически здоровых обезьян макаков резус [1-3], для которых характерно наличие мРНК ИФН-?, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-18 (у 80-100% особей), мРНК ИЛ-1? и ФНО-? (у 60%), а мРНК ИФН-?, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12 (у 20-40% обезьян). В наших исследованиях было показано (табл. 1), что у обезьян, носителей SV-40, транскрипция ИФН-?, ИЛ-2 и ИЛ-18, цитокинов, относящихся Th1-типу, регистрировалась на уровне здоровых животных. По сравнению с нормой у инфицированных животных была отмечена активация экспрессии генов ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-? и угнетение экспрессии генов ИФН-?, ИЛ-1?, ИЛ-6, ИЛ-10. Причем, изменения синтеза мРНК ИЛ-1?, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-8 наблюдались у 40-50% обезьян, а мРНК ИФН-?, ИЛ-10, ИЛ-12 и ФНО-? – у 20-30 % животных. Наши данные частично подтверждают и дополняют литературные данные. Таблица 1 Экспрессия генов цитокинов у обезьян (n =10), носителей SV-40, до и вовремя терапии иммуномодулирующими препаратами мРНК цитоки-нов Количество обезьян (в %) с выявленной мРНК цитокинов Норма SV-40 При лечении циклофероном При лечении препаратом А-вода через1 ме-сяц через2 ме-сяца через1 ме-сяц через2 ме-сяца ? ? ? ? ? ? ? ? ИНФ-? 96 70 40 20 20 0 40 40 60 0 ИНФ-? 40 50 0 60 20 0 20 20 20 20 ИЛ-1? 64 20 20 20 20 0 20 20 20 20 ИЛ-2 76 80 20 40 20 20 60 20 20 0 ИЛ-4 28 70 60 0 0 60 20 40 0 40 ИЛ-6 80 30 0 40 0 20 20 20 20 0 ИЛ-8 20 60 20 60 0 40 60 40 0 0 ИЛ-10 36 10 0 0 0 60 0 0 0 40 ИЛ-12 36 60 40 0 20 20 60 40 20 20 ИЛ-18 84 90 0 80 80 20 20 20 40 20 ФНО-? 56 80 0 40 20 60 20 60 20 40 Примечание: ?- активация транскрипции цитокина, ? - угнетение транскрипции цитокина Далее была проведена проверка влияния иммуномодулирующих препаратов, обладающих антивирусной активностью, на иммунную систему обезьян. Следует отметить, что через 2 месяца приема циклоферона или препарата А-вода у 30% обезьян не обнаруживался SV-40. При этом у обследуемых животных через месяц применения циклоферона отмечалась активация экспрессии генов ИЛ-4 и ИЛ-12 и подавление – ИФН-?, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, ФНО-?. А после 2-х месяцев терапии циклофероном была обнаружена активация транскрипции ИЛ-18 и угнетение – ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-?. Использование А-воды в течении 1-2-х месяцев приводило к активации транскрипции ИЛ-2 и ИФН-? и подавлению - ИЛ-4, ИЛ-10, ФНО-?. Т.е. можно предположить, что положительный эффект терапии иммуномодуляторами наступает за счет как их антивирусных, так и цитокинмодулирующих свойств. Видно, что исследованные препараты в разной степени активировали в организме обезьян механизмы клеточного иммунитета (ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-18), нормализуя функции гуморального иммунитета (ИЛ-4, ИЛ-10) и макрофагов (ИЛ-8, ФНО-?). Результаты обследования людей и обезьян методом ПЦР анализа после проведенной терапии представлены в таблице №2. Заключение Исходя из данных литературы и полученных нами, можно предположить, что при медленной инфекции, вызванной SV-40, протекающей бессимптомно, у обезьян подавляются функции клеточного звена иммунитета, В-лимфоцитов и Treg-лимфоцитов, но при этом активируется гуморальное и макрофагальное звенья иммунитета. Использование для лечения этой инфекции иммуномодулирующих препаратов (циклоферон, А-вода) приводит к активации в организме обезьян механизмов клеточного иммунитета и нормализации функций гуморального иммунитета и макрофагов, что сопровождается исчезновением вируса из организмалюдей и обезьян. Как известно, вирусоносительство SV40 носит персистентный характер, чередуясь периодами реактивации. Освобождение от персистентной SV40 вирусной инфекции важно еще и потому, что было обнаружено спонтанное образование рекомбинантов между аденовирусом и Таблица №2 Эффективность иммунотерапии людей и обезьян иммуномодулирующими препаратами Количество обследуемых Носительство SV40 ( число вирусотрицательных/ число обследованных Исходно % Монотерапия Комплексная терапии Циклоферон + Авода Авода Циклоферон Через 2 месяца лечения Через 3 месяца лечения Через 2 месяца лечения Через 3 месяца лечения Через 2 месяца лечения Через 3 месяца лечения Обезьяны 17 100 1/5 (20%) 1/5 (20%) 1/5 (20%) 1/5 (20%) 1/7 (14,2%) 3/7( 42,8%) Люди 7 100 2/5(40%) 3/5 (60%) 1/2 (50%) 1/2 (50%) Не проводили Эффективность лечения обезьян Аводой и циклофероном отдельно составила 20%. Более успешной была комплексная терапия циклоферон +Авода, эффективность которой через 3 месяца после лечения составила 42,8%. вирусом SV40, т.е. между двумя неродственными вирусами, что может иметь непредсказуемые клинические последствиях [18]. В применной нами комбинации средств определенную нагрузку несет Авода, способная проникать через клеточную мембрану [4] и в ряде случаев способствующая развитию продуктивной инфекции, когда вирус вне клетки доступен для антивирусных препаратов. Дальнейшие исследования в этой области , в частности, изменение схем и длительности воздействия препаратов на организм позволит предложить новые схемы противовирусной терапии. Литература 1.Агрба В.З., Лапин Б.А., Мезенцева М.В. и др. Перспективы изучения интерферонового статуса приматов для оценки адекватности его при моделировании патологических состояний человека на обезьянах. В кн.: Сборник материалов научно-практической конференции «Медицина будущего», Краснодар-Сочи; 2002:121 2.Агрба В.З., Лапин Б.А., Мезенцева М.В., Карал-оглы Д.Д., Сургучева И.М., Игнатова И.Е., Щербенко В.Э., Агумава А.А., Афанасьев Н.А. Показатели функционирования системы цитокинов у лабораторных приматов. БЭБИМ, 2009, № 8, стр. 223-225. 3. Агрба В.З., Мезенцева М.В., Сургучева И.М., Карал-оглы Д.Д., Лапин Б.А., Ершов Ф.И. Интерфероновый статус и цитокиновый профиль у приматов в норме. В материалах международной научной конференции: Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах». Сочи-Адлер; 2007, стр. 111-118 4. Постнов С.Е. Роль воды пограничного слоя в живом организме. Биофизическаа модель. \\ Биомедицинская радиотехника, 2008, №12, стр . 52-56 5. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. \\ С.Петербург, Фолиант, 2008, 550 с. 6.Лапин Б.А., Чикобава М.Г.Эпидемиология обезьяньего вируса SV40 в разных регионах Российской федерации. БЭБиМ, 2009,№12, стр. 68-76 7.А.Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. Иммунология. М., Мир, 2000, 582 с. 8.Asamitsu K., Sakurada S., Mashiba K., Nakagawa K., Torikai K., Onozaki K. and Okamoto T. Alteration of the cellular response to interleukin-1? by SV40 large T antigen in rheumatoid synovial fibroblasts Archives of Virology 1998, V. 144, N 2, р. 317-327 9.Bigazzi P.E., Yoshida T., Ward P.A. and Cohen S. Production of lymphokine-like factors (cytokines) by simian virus 40- infected and simian virus 40-transformed cells. American Journal of Pathology, 1975, Vol. 80, р. 69-78. 10.Carbone, M., et al. SV-40 Like Sequences in Human Bone Tumors. Oncogene, 1996, 13(3), р.527-535. 11.Carter J.J., Paulson KG, Wipf GC, et al. Association of merkel cell polyomavirus-specific antibodies with merkel cell carcinoma. Journal of the National Cancer Institute, 2009, 101 (21), р. 1510–1522. 12.Feng H., Shuda M., Chang Y., Moore P.S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science, 2008, 319 (5866), р. 1096–1100. 13.Gerritsma J.S., van Kooten C., Gerritsen A.F., Mommaas A.M., van Es LA, Daha M.R. Production of inflammatory mediators and cytokine responsiveness of an SV40-transformed human proximal tubular epithelial cell line. Exp Nephrol., 1998, 6(3), р.208-16. 14.Sippy B.D., Hofman F.M., He S., Osusky R., Sheu S.J., Walker S.M., Ryan S.J., Hinton D.R. SV40-immortalized and primary cultured human retinal pigment epithelial cells share similar patterns of cytokine-receptor expression and cytokine responsiveness. Curr. Eye Res., 1995, 14(6), р.495-503. 15.Shimozato O., Watanabe N., Goto M., Kobayashi Y. Cytokine production by SV40-transformed adherent synovial cells from rheumatoid arthritis patients. Cytokine,1996, 8(1), р.99-105. 16.Suzuki T., Sullivan D. A. Comparative effects of estrogen on matrix metalloproteinases and cytokines in immortalized and primary human corneal epithelial cell cultures. Cornea, 2006, 25(4), р.454-459 17.Yang N.S., Wang J.H., Turner J. Molecular strategies for improving cytokine transgene expression in normal and malignant tissues. Gene Therapy, 2004, 11, р.100–108. 18. Levis A.M. SV40 in adenovirus vaccines and adenovirus – SV40 recombinants \\ Dev. Biol. Stand.- 1998, vol 94,P/207-216 PECULIARITIES OF REGULATORY CYTOKINE GENE EXPRESSION IN MONKEYS SV40 CARRIERS M. Mesentseva1, V. Agrba2, S. Postnov1, Karal-ogly D.D.2, I. Shapoval1, N. Afanasiev2, L. Russu1 , A. Agumava2, T. Gvozdik2, B. Lapin2 1.- N. Gamaleya Institute of Microbiology and Epidemiology, Moscow, Russia 2. – RI MP RAMN, Sochi, Russia The research is devoted to revealing regulatory genes expression in?? at M.mulatta with latent SV40 infection and to study efficiency of immunomodulating drugs (mono drugs or its combination). Cyclopheron (produced by pharmacological company “Polisan”) independently and in combination with “Awater” were used. “Awater” is drinking water obtained from division of artesian layer of water attached to the surface of an object from volume water which according to physical properties differ from initial. It has been shown that at infected animals, activation of IL-4, IL-8, IL-12, and TNF-?? genes expression was detected and expression of TFN-???IL-1???IL-6, IL-10 genes was inhibited. Changes of IL-1???IL-4,IL-6 and IL-8 mRNA synthesis was revealed in 40-50% at monkeys and TFN-?? IL-10, IL-12 and TNF-?? mRNA synthesis change was revealed in 20-30% of animals. Efficacy of treatment of monkeys in comparison with treatment of humans was evaluated by detecting SV40 sequences in blood by Real-time PCR. Efficacy of “Awater” and cyclopheron separately (2-3 months after treatment) was 20% at monkeys. More successful was complex therapy of combination “cyclopheron+Awater”, efficiency of which was 42.8% after 3 months of treatment. After monotherapy in humans efficacy was 50-60%. Authors evaluate the results of therapy as preliminary. It is assumed that further research in this area in particular changing of treatment schemes and duration of drugs reception will allow developing new schemes of antivirus therapy. ОБЕЗЬЯНЫ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПЕРСИСТЕНЦИИ И ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ПРИРОДНЫХ И ИСКУСТВЕННО АТТЕНУИРОВАННЫХ БАКТЕРИЙ BORDETELLA PERTUSSIS Шевцова З.В.*, Кубрава Дж.Т.*, Медкова А.Ю.**, Синяшина Л.Н.**, Конджария И.Г.*, Матуа А.З.*, Елистратова Ж.В.*, Каратаев Г.И.**, Миквабия З.Я.* *НИИ экспериментальной патологии и терапии АНА, Сухум, Абхазия **ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи МЗ РФ, Москва, Россия Коклюш является актуальной проблемой в здравоохранении в связи с высокой заболеваемостью и смертностью во всех странах мира. Наиболее эффективным мероприятием в борьбе с этой инфекцией является вакцинопрофилактика. Используемые в настоящее время две АКДС – вакцины (цельноклеточная и бесклеточная) вводят в организм не естественным для заражения интраназальным путем, а инъекционно. Создаваемый ими иммунитет несколько ниже его продолжительности после перенесенного заболевания. Кроме того наблюдались случаи местных и общих поствакцинальных реакций, увеличивающихся с возрастом вакцинируемых детей. В НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ проводятся исследования по усовершенствованию коклюшных вакцин. Сконструированы искусственно аттенуированные бактерии B. pertussis KS (ИА B. p. KS), несущие две мутации в генах ptx и dnt, продуцирующие КТ в нетоксичной иммуногенной форме и не проявляющие активности дермонекротического токсина (dnt). Защитные и токсические свойства ИА B. p. KS были изучены нами на мышах линии BALB/c, морских свинках и кроликах [7]. Однако, для более полной характеристики защитных свойств этих бактерий необходима проверка их иммунобиологических свойств на адекватной для человека экспериментальной модели, какой, как известно, для многих инфекций являются обезьяны. В литературе имеются сообщения о воспроизведении ряда признаков коклюшной инфекции у тайваньских макак [8] и у мармозет [9]. Однако, сведения об их использовании в качестве модели отсутствуют, по-видимому, в связи с тем, что эти виды обезьян практически не доступны для экспериментов. Целью данной работы являлось выяснение восприимчивости к интраназальному введению бактерий коклюша более доступных для исследований обезьян Старого Света. Всего было использовано десять обезьян Сухумского питомника (возраст 2-5 лет), находящихся по клиническим и лабораторным данным в состоянии соматического здоровья. Восьми обезьянам (4 макака резуса, 2 яванских макака и 2 павиана гамадрила) ввели природные бактерии Bordetella pertussis 231 (B. p. 231), а двум макакам резусам – искусственно аттенуированные ИА B. p. KS [Таб.1]. Обезьянам в каждую ноздрю вводили по 0,5 мл суспензии, содержащей 2?109 живых бактерий. Обследование животных проводили в разные сроки после инфицирования в течение четырех месяцев. Обследование включало: общий клинический анализ крови, взятие содержимого носоглотки, посев его на селективную питательную среду КУА (казеиново-угольный агар) с параллельной идентификацией бактерий в реакции агглютинации со стандартной противококлюшной сывороткой и ДНК-анализом методом ПЦР с тест-системами, разработанными НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ и ЗАО «Синтол», Москва. Для определения специфических противококлюшных антител в сыворотке использовали диагностикум ОАО «Биомед», Москва. Иммунофенотипирование популяций и субпопуляций лимфоцитов проводили с помощью моноклональных антител к их кластерам дифференцировки по Новикову [6] с использованием наборов «БААКИ», Беларусь. Содержание сывороточных иммуноглобулинов ( IgM, IgA, IgG) определяли в реакции радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини с моноспецифическими сыворотками [2] с использованием диагностического набора «ИмБио», Россия. Комплексное исследование нейтрофильных гранулоцитов, их поглотительную (% ФАН) и переваривающую способность (% ФПК в спонтанном и стимулированном НСТ-тестах) проводили по методическим рекомендациям [5]. Ни у одной подопытной обезьяны не было отмечено внешних клинических проявлений коклюша (кашель, рвота). Однако в первые 2-3 недели у них наблюдались катаральные явления слизистой носоглотки. Результаты исследования содержимого носоглотки, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что введенные бактерии в ней сохранялись и размножались. Таблица 1 Результаты ПЦР анализа ДНК B.pertussis и бактериологического посева отделяемого носоглотки обезьян. При посеве этого материала на среду КУА рост колоний бактерий, идентифицированных как B.pertussis, наблюдался на 14-28 дни после инфицирования. При использовании ПЦР-анализа персистенцию природных B.p. 231выявляли на протяжении 90 дней, а аттенуированных ИА B. p. KS – в течение 36 дней. С 14 дня в реакции агглютинации определялись специфические противококлюшные антитела в титрах 1:103- 1:104. К 30 дню титры возросли до 1:3?104, сохранялись на уровне 1:104 - 1:3?104 в течение 2-3 месяцев, постепенно снижались и к 4 месяцу составляли 1:102 и ниже. Вид бактерий Сроки после введения (дни) Маркеры лимфоцитов (%) Средние показатели (пределы) Количество иммуноглобулинов г/л, пределы значений CD3 CD4 CD8 CD19 ИРИ IgM IgG IgA Общее количество B.p. 231 до 45,5 (40-51) 31,5 (30-33) 23,5 (19-28) 19,5 (19-20) 1,3 1,0-1,1 7,0-7,9 3,1-3,4 11,1-12,4 14 50,5 (45-56) 34,5 (33-36) 25,0 (20-30) 25,5 (22-29) 1,4 1,2-1,4 8,8-9,7 3,2-3,5 13,2-14,6 30 48,5 (44-53) 32,5 (30-35) 25,0 (21-29) 27,0 (24-30) 1,3 1,2-1,6 10,7-14,9 3,2-3,5 15,1-20,0 60 48,0 (44-52) 34,0 (32-36) 20,0 (19-21) 27,0 (26-28) 1,7 1,3-2,1 11,9-13,1 3,5-4,0 16,7-19,2 120 42,5 (42-43) 25,5 (23-28) 18,5 (18-19) 24,0 (22-26) 1,4 1,6-2,1 16,3-17,3 4,0-5,0 21,9-24,4 ИА B.p. KS до 46,0 (40-52) 26,5 (20-33) 23,5 (18-29) 23,5 (21-26) 1,1 1,1-1,2 7,9-8,0 3,0-3,2 12,0-12,4 14 53,0 (50-56) 30,5 (30-31) 23,5 (22-25) 25,5 (23-28) 1,3 1,6-1,9 8,8-9,7 2,2-3,5 12,6-15,1 30 53,0 (51-55) 32,5 (32-33) 25,0 (24-26) 26,0 (25-27) 1,3 1,2-1,3 11,9-14,9 3,2-4,0 16,3-20,2 60 52,0 (50-54) 33,0 (32-34) 25,5 (25-26) 27,5 (27-28) 1,3 2,1-2,5 16,2-16,3 3,5-4,0 21,8-22,8 120 44,5 (44-45) 25,0 (23-27) 18,0 (17-19) 23,5 (23-24) 1,4 2,1-2,1 17,9-19,5 4,0-4,5 24,0-26,1 У всех обезьян на 3-14 день в периферической крови наблюдался лейкоцитоз. Количество лейкоцитов возрастало с 6-8 тыс/мкл до 18-20 тыс/мкл. При этом увеличивались и процент нейтрофильных гранулоцитов и их фагоцитарная активность. Процент активно фагоцитирующих нейтрофилов (% ФАН), характеризующий их поглотительную способность, повышался с 48 до 62. Активировались и кислородзависимые механизмы переваривания по показателям НСТ-теста: процент формазан-позитивных клеток (% ФПК) увеличивался в среднем в 5 раз, при этом коэффициент мобилизации составлял 2,4-4,6 у.е. Количество естественных киллеров (ЕК) CD16 – лимфоцитов закономерно увеличивалось с 17,5 до 23,5% . В таблице 2 представлены результаты показателей клеточного и гуморального звеньев адаптивного иммунитета. Как видно из данных таблицы, количество CD3 и CD4 Т – лимфоцитов у всех обезьян несколько увеличивалось в течение 60 дней, а к 4 месяцу было даже немного ниже нормы. Таблица 2. Клеточные и гуморальные показатели адаптивного иммунитета у инфицированных макак резусов в динамике. Количественное содержание CD8 Т – лимфоцитов сохранялось практически на одном уровне, но к 120 дню также снижалось. Процент CD19 B – клеток закономерно возрастал в течение 2-х месяцев, увеличивалась и их функциональная активность, выраженная в продукции иммуноглобулинов. При этом содержание IgM и IgA умеренно увеличивалось, а общий уровень сывороточных иммуноглобулинов (Ig) постепенно повышался в основном за счет IgG и к 4 месяцу был в 2 раза выше исходного. Следует отметить, что исходные гематологические и иммунологические показатели, характеризующие врожденный и адаптивный иммунитет у всех обезьян находились в пределах их нормативных колебаний, установленных ранее. [ 1,3,4 ] Таким образом, при интраназальном введении бактерий B.pertussis обезьянам трех использованных в работе видов наблюдалась однотипная реакция, как на введение природных бактерий, так и на аттенуированных. Это выражалось в появлении воспалительных и катаральных явлений в верхних дыхательных путях и в сохранении и размножении в них бактерий. Путем высева смывов носоглотки на селективную питательную среду и методом ПЦР было выявлено, что персистенция B.p.231 была более длительной, чем ИА B. p. KS. Несмотря на отсутствие внешних клинических проявлений, характерных для коклюша людей (пароксизмальный кашель, рвота), интраназальное введение бактерий B. pertussis вызывало в организме обезьян, в частности макак резусов, развитие лабораторно выявляемых изменений и выраженный иммунный ответ. Все вышеизложенное позволяет предложить макак резусов в качестве модели для изучения персистенции возбудителя коклюша и иммуногенных свойств бактерий, перспективных для создания новых противококлюшных вакцин. Список литературы: 1. Баркая В.С., Елистратова Ж.В., Чалукян С.А. и др. Клиноко-гематологические показатели макак резусов различного возраста. //Вопросы биологии и патологии приматов. Материалы науч. конф., Сухум, 10июля 2008.- С.17-25. 2. Иммунологические методы. Под ред. Фримеля Г.-М: Медицина, 1987.-С.82-88. 3. Матуа А.З., Шевцова З.В. Показатели специфического и неспецифического иммунитета у макак резусов в сравнительно-возрастном аспекте. //Кубанский научный медицинский Вестник. -2007. -№1. – С.98-101 4. Матуа А.З. Сравнительно-возрастные аспекты иммунного статуса низших обезьян (макак резусов и павианов гамадрилов).//Автореферат диссертации канд. биол. наук. С.- Петербург, 2010. 5. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А. Комплексное трехуровневое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой ИДС при различной патологии //Методические рекомендации №9 6/11.-Краснодар,1996.-22с. 6. Новиков П.Д., Новиков Д.К. Сравнительная характеристика современных методов иммунофенотипирования лимфоцитов // Иммунопатология, аллергология и инфектология.- 2000.-№ 1.- С.62-66. 7. Синяшина Л.Н., Синяшина Л.С., Семин Е.Г., Амелина И.П., Каратаев Г.И. (2010) Конструирование аттенуированных бактерий Bordetella pertussis, утративших активность дермонекротическогго токсина и продуцирующих измененную нетоксическую форму коклюшного токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №3. 8. Huang C.C., Cuien P.M., Kuo J. K. et al. Experimental whooping cough // J. of Medicine.- 1962.- Vol.266.- №3.-P.105-110 9. Stanbridge T.N., Preston N.W. Experimental pertussis infection in the marmoset: type specificity of active immunity // J. Hyg. Camb. – 1974.- №72.- P. 213-228. MONKEYS AS EXPERIMENTAL MODELS TO STUDY THE PERSISTENCE AND IMMUNE RESPONSE DURING THE INTRANASAL ADMINISTRATION OF NATURAL AND ARTIFICIALLY ATTENUATED BACTERIA BORDETELLA PERTUSSIS Shevtsova Z.V., Kubrava D.T., Medkova A.Y., Siniashina L.N., Kandzariya I.G., Matua A.Z., Yelistratova Zh.V., Karataev G.I., Mikvabiya Z.Y. Institute of Experimental Pathology and Therapy, ASA Sensitivity of monkeys to intranasal infusion of Bordetella pertussis was studied. Natural bacteria B.p. 231 were introduced to eight monkeys of three species ( 4 rhesus macaques, 2 cynomolgus macaques and 2 hamadryas baboons). Artificially attenuated bacteria IA B.p. KS with mutations in ptx and dnt genes were introduced to 2 rhesus monkeys. All the monkeys were free of clinical signs such as cough and vomiting. However, during the first 2-3 weeks the catarrhal symptoms of nasopharyngeal mucosa were noted. The results of the analysis of nasopharyngeal contents show that the bacteria administrated to animals have been persisting and propagating. Inoculation of the material for the selective medium showed their growth during the period of 14-28 days.Using the PCR-analysis the persistence of B.p.231 was detected during 90 days, and the persistence of attenuated IA B.p. KS – for 36 days. On the 3rd -14th days leukocytosis was found in the perpheral blood of all the monkeys. In this period an activation of natural immunity was noted with rising of absorbing capacity of neutrophilic granolocytes (% PAN) and of their digestion capacity (% FPC in HCT-tests). Lymphocyte phenotyping did not show significant changes in the quantitative content of their populations and subpopulations. Along with it the activation of B-chain function of immune system was noted. It was evidenced by the increase of specific antipertussis antibody titres (agglutinines) and by the growth of a total immunoglobulin ammount mainly for account Ig of G-class. The results show that intranasal administration of Bordetella pertussis bacteria to monkeys results in the development of symptoms characteristic for pertussis infection which can be detected using the laboratory methods. These data support the value of monkeys as models for evaluation of immunogenicity and protective characteristics of first-rate antipurtussis vaccine drugs. МАРКЕРЫ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ЛАБОРАТОРНЫХ ПРИМАТОВ Корзая Л.И., Кебурия В.В., Гончаренко А.М., Догадов Д.И., Лапин Б.А. НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Целый ряд вирусных инфекций, таких как корь, гепатит А (ГА), гепатит Е (ГЕ), ротавирусная, энтеровирусная и аденовирусная инфекции являются эндемичными среди обезьян многих приматологических центров мира [3,5,6,7,8]. Большинство вирусов обезьян являются «двойниками» вирусов человека, роль которых в патологии при перекрестном заражении изучается. Определение маркеров вирусных инфекций у лабораторных приматов является необходимым этапом при специфической лабораторной диагностике как острых, так и анамнестических случаев, а также для оценки уровня иммунитета и оценки эпидемической ситуации по многим инфекциям. Целью настоящей работы было обобщение данных, полученных при изучении маркеров эндемически значимых инфекций среди лабораторных приматов Адлерского приматологического центра. Материалы и методы. Исследования проводили на базе лаборатории инфекционной вирусологии НИИ МП РАМН с использованием материалов от обезьян, собранных в 1999-2010 гг. Сыворотки. Всего исследовано 5080 образцов сывороток от различных видов обезьян, содержащихся на разных участках питомника. Среди обследованных животных были макаки резусы (Macaca mulatta), макаки яванские (M. fascicularis), макаки лапундеры (M. nemestrina), зеленые мартышки (Cercopithecus aethiops), павианы гамадрилы (Papio hamadryas) и павианы анубисы (Papio anubis). Фекальные образцы. Исследовано 569 образцов от обезьян различных видов. Определение антител к вирусу гепатита Е (анти-ВГЕ). Использовали коммерческие иммуноферментные диагностические тест-системы - "ДС-ИФА-АНТИ-HEV-G" и "ДС-ИФА-АНТИ-HEV-M", производства НПО "Диагностические системы" (Нижний Новгород). Определение антител к вирусу гепатита А (анти-ВГА). Использовали коммерческие иммуноферментные диагностические тест-системы - "ДС-ИФА-АНТИ-HAV-G" и "ДС-ИФА-АНТИ-HAV-M", производства НПО "Диагностические системы" (Нижний Новгород). Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре «Униплан» отечественного производства с использованием фильтра с длиной волны 450 нм. Реактивность сывороток в отношении ВГЕ оценивалась по значениям ОП450 (оптическая плотность исследуемых образцов сывороток при длине волны 450 нм в ИФА). Определение антигена ротавируса в фекалиях методом ИФА. Использовали диагностическую тест-систему - «Ротавирус-антиген-ИФА-Бест», производства ЗАО «Вектор - Бест», Новосибирск. Определение антигена и антител к ротавирусу методом реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и методом реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Использовали диагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуноглобулиновый «РОТАТЕСТ», производства Ростов. Детекцию РНК энтеровируса и ВГЕ проводили методом RT-PCR -полимеразной цепной реакции, сопряженной с реакцией обратной транскрипции с использованием коммерческой тест-системы «GeneParkTM RNA PCR test» (производства Biokom, Москва). Кроме того, для выделения энтеровируса от обезьян был использован биологический метод заражения культуры клеток почки зеленой мартышки (Vero). Определение антител к виру кори проводили в ИФА с помощью коммерческих ИФА тест-системы “ВектоКорь IgG” производства ЗАО “Вектор-Бест", Новосибирская обл., пос. Кольцово и «ИФА-Корь-IgG» производства ЗАО «Эколаб» (Московская обл., г. Электрогорск.). Кроме того, применяли метод РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) с использованием диагностикума эритроцитарного коревого антигенного сухого (КЭД-90), производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Результаты исследования. Маркеры гепатита А. Общая частота распространения анти-ВГА IgG среди обезьян (n=527) составила 82,9% (табл.). Анти-ВГА были обнаружены у всех обследованных видов обезьян (макака резусы, макаки яванские, зеленые мартышки, павианы гамадрилы и павианы анубисы). Показатели варьировали в зависимости от вида (75-97,7%) и места содержания обезьян (52-100 %). Наличие IgM позитивных особей по анти-ВГА (11,1%) является показателем наличия острой инфекции среди обезьян. Практически во всех вольерах были обнаружены особи с анти-ВГА IgM, что свидетельствует об активности эпизоотологического процесса. Количество анти-ВГА IgM - позитивных обезьян в вольерах среди макак резусов варьировал от 3,2 до 42,1% и суммарно составил 13,2%. Помимо серологического подтверждения циркуляции ВГА среди обезьян, нам удалось выделить и антиген ВГА в 10,7% исследованных фекальных проб от макак резусов и макак яванских. Кроме того, нам также удалось проследить развитие «свежих» случаев спонтанного гепатита А у макак (в основном, резусов), находящихся на различных участках питомника. Инфекция сопровождалась выделением вируса с фекалиями и появлением специфических антител (IgG и IgM). По продолжительности обнаружения АлАТ и его уровню, течение инфекции оценивалось как легкое. Морфологические изменения в печени либо отсутствовали, либо были непостоянны и минимальны. Отмечен факт длительного (2-8 месяцев) обнаружения антигена ВГА в фекалиях у некоторых обезьян. Таблица Частота обнаружения маркеров вирусных инфекций у обезьян различных видов. Вирусные инфекции Маркеры Макаки резусы Макаки яванские Макаки лапундеры Зеленые мартышки Павианы гамадрилы Павианы анубисы Итого: Гепатит А: анти-ВГА IgG 259/311* (83,3) 72/92 (78,3) -** 42/43 (97,7) 42/56 (75) 22/25 (88) 437/527 (82,9) анти-ВГА IgM 42/317 (13,2) 6/119 (5,0) - 9/43 (20,9) 1/35 (2,9) 1/17 (5,9) 59/531 (11,1) ВГА-АГ 17/146 (11,6) 3/34 (8,8) - - 0/7 (0) - 20/187 (10,7) Гепатит E: анти-ВГЕ IgG 468/894 (52,3) 38/309 (12,3) 2/50 (4,0) 3/106 (2,8) 0/102 (0) 102/78 (0) 511/1539 (33,2) анти-ВГЕ IgM 12/418 (2,9) 8/177 (4,5) 0/16 (0) 0/3 (0) - 0/4 (0) 20/618 (3,2) Ротавирусная инфекция анти-ротавирус 72/72 (100) 14/15 (93,3) - 20/20 (100) 12/12 (100) 10/10 (100) 128/129 (99,2) АГ ротавируса 46/138 (33,3) 18/100 (18,0) 5/12 (41,7) 69/250 (27,6) Аденовирусная инфекция Анти-аденовирус 20/20 (100) 10/10 (100) - - - - 30/30 (100) АГ Аденовируса 7/37 (18,9) 1/5 (20) 1/2 (50) - 1/1 - 10/45 (22,2) Энтеровирусная инфекция РНК энтеровируса 24/55 (43,6) 6/22 (27,3) - - 2/10 (20) - 32/87 (36,8) Корь Анти- кори IgG 24/181 (13,3) 1/64 (1,6) - 0/20 (0) 1/20 (5) 0/48 (0) 26/333 (7,8) Анти- кори IgM 0/29 (0) 0/35 (0) - - 0/32 (0) 0/32 (0) 0/128 (0) Примечание: * - Количество позитивных/ число обследованных (%). ** - не исследовали. Маркеры гепатита Е. Общая частота распространения анти-ВГЕ IgG среди обезьян (n=1539) составила 33,2% (табл.). Показана видовая чувствительность к ВГЕ обезьян рода макак: макаки резусы – 52,3% (n=894), макаки яванские – 12,3% (n=309), макаки лапундеры - 4,0% (n=50) [6] и зеленых мартышек – 2,8% (n=106). Показатели IgG варьировали в зависимости от места содержания обезьян (10-88,9%). Факт наличия анти-ВГЕ IgM у 2,7% макак резусов и 4,3% макак яванских свидетельствует о случаях острой инфекции среди них. Не выявлено причастности вирусного агента (ВГЕ) к заболеваниям желудочно-кишечного тракта обезьян (в основном, макак резусов) по материалам вспышки желудочно-кишечных заболеваний 2009 года. Частота распространения анти-ВГЕ IgG как среди больных, так и среди погибших макак с желудочно-кишечной патологией была невысокой (35,7% и 17,2% соответственно) при отсутствии анти-ВГЕ IgM. Получены предварительные данные об отсутствии РНК ВГЕ (метод RT-PCR) в сыворотках и фекалиях анти-ВГЕ IgM - позитивных обезьян. Исследования по выявлению генома ВГЕ продолжаются. Маркеры ротавирусной инфекции. Получены данные о высокой частоте распространения антител к ротавирусу (табл.) среди обследованных обезьян – 99,2% (n=129) в реакции РТНГА. Титры антител у обезьян варьировали в пределах 1:8-1:256. Средняя арифм. титра составила 1:77. Установлено, что наиболее высокие значения титров были зарегистрированы у павианов гамадрилов и макак резусов (средняя арифм. титра составила 1:85 и 1:84 соответственно), средние титры - у макак яванских и зеленых мартышек (1:73 и 1:67) и наименьшие титры – у павианов анубисов (1:43). Проведенный анализ свидетельствует о том, что доминирующее число (91,6%) позитивных к ротавирусу сывороток от практически здоровых обезьян имели средние титры антител (1:32-1:128), а остальные (8,4%) – высокие (1:256) и низкие (1:16). В группе подростков (1-3 года) встречались особи с различными титрами антител - в диапазоне от 1:16 до 1:256. В сыворотках молодых животных (3-5 лет) обнаруживались только титры 1:64 и 1:128, а в группе взрослых обезьян - 1:16-1:128. Вместе с тем, не отмечалось значительной разницы в средних титрах антител между тремя возрастными группами обезьян от 1 до 3-х лет (1:89), от 3-х до 5 лет (1:96) и от 5 до 20 лет (1:72). На примере павианов гамадрилов было показано, что титр антител к ротавирусу у погибших животных с патологией желудочно-кишечного тракта был в 6,1 раза ниже (1:14), чем у практически здоровых обезьян (1:85). Полученные серологические данные свидетельствуют о высокой степени циркуляции ротавируса среди всех обследованных видов обезьян питомника. Большое значение имеют данные по обнаружению антигена ротавируса в фекалиях 27,6% обследованных обезьян (n=250). Ротавирусный антиген был выявлен у макак резусов (33,3%), макак яванских (18,0%) и у павианов гамадрилов (41,7%). Было показано, что ротавирус-содержащие пробы выявлялись в 2,6 раза чаще (48,3%) от погибших обезьян с диарейными заболеваниями (n=29), чем от практических здоровых животных - 18,7% (n=166). Это свидетельствует, по-видимому, о немаловажной роли ротавируса в патологии желудочно-кишечного тракта обезьян, а также о наличии вирусоносительства у практически здоровых животных. Маркеры энтеровирусной инфекции. Энтеровирусы являются одним из этиологических факторов кишечных инфекций человека и обезьян. РНК энтеровируса (табл.) была обнаружена в фекалиях 36,8% обследованных обезьян (n=45). Среди макак резусов было выявлено 43,6% содержащих РНК особей, среди макак яванских – 27,3%, среди павианов гамадрилов – 20%. Проведен анализ содержания РНК в фекальных пробах 71 обезьяны, в том числе, от больных обезьян с диареей (n=18), от погибших животных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта (n=38), а также от клинически здоровых обезьян (n=15). Среди обследованных обезьян были макаки резусы (n=40), павианы гамадрилы (10) и другие виды животных (n=21). РНК энтеровируса была обнаружена в образцах фекалий от больных обезьян с диареей (38,9%), от погибших животных с различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта (39,4%) и почти в 2 раза реже - от клинически здоровых обезьян (20,0%). Наблюдалась значительная разница между количеством содержащих РНК энтеровируса обезьян в зависимости от их вида (46,2% и 14,2% среди макак резусов у павианов гамадрилов соответственно). Следует подчеркнуть, что энтеровирус был выделен в культуре Vero в одном (8,3%) из 12 исследуемых фекальных образцов от погибших обезьян с желудочно-кишечной патологией. О размножении вируса в культуре Vero свидетельствовал цитопатический эффект (на 7 сутки после 1-го пассажа и 3-и сутки после 2-го пассажа) и обнаружение генома энтеровируса методом ПЦР в культуральных пробах после 1-ого и 2-го пассажа. Полученные данные, по-видимому, свидетельствуют об определенной роли энтеровируса в патологии желудочно-кишечного тракта обезьян, а также о наличии вирусоносительства у практически здоровых животных. Целенаправленные исследования в этом направлении будут продолжены. Маркеры аденовирусной инфекции. Антитела к аденовирусу (табл.) были обнаружены у 100 % обследованных макак резусов и макак яванских (n=30) в РТНГА. Ср. арифм. титра антител к аденовирусу в группе клинически здоровых животных составила 1:115,2. Титры антител у отдельных особей варьировали от 1:64-1:128. Антиген аденовируса был обнаружен в фекалиях 22,2% обследованных обезьян (n=45) в РНГА. Проведен анализ выявления маркеров кишечной аденовирусной инфекции в группе обезьян с желудочно-кишечной патологией. Антиген аденовируса был обнаружен у 46,7% погибших и 39,3 % больных макак с патологией желудочно-кишечного тракта, при этом титр антител к аденовирусу составил 1:50,3 и 1:70 соответственно в этих группах животных. Маркеры кори. Корь является типичной антропонозной инфекцией, зарегистрированной как спонтанное заболевание не только у человека, но и у обезьян. Частота распространения антител к вирусу кори среди обезьян различных видов (по материалам 1999-2010 гг.) оказалась крайне низкой и составила 7,8% (n=333). Позитивные по кори сыворотки были обнаружены у 13,3% макак резусов (n=181), 1,6% макак яванских (n=54) и у 5% павианов гамадрилов (n=20), в то время как среди зеленых мартышек (n=20) и павианов анубисов (n=48) серопозитивные животные не регистрировалис. Обращает внимание, что позитивные особи были обнаружены лишь среди обезьян, рожденных в 1984-1990 гг. Титр противокоревых антител в сыворотках обезьян варьировал от 1:20 до 1:160 (РПГА). Реактивность сывороток к вирусу кори (ИФА) в сыворотках обезьян варьировала от 0,887 ОП450 до 2,03 ОП450 (0,65 - 4,6 МЕ/мл). Антитела IgM не были также обнаружены ни у одной из обследуемой обезьяны (n=128), что свидетельствует об отсутствии «свежих» случаев инфекции за последние годы. Вызывает обеспокоенность отсутствие иммунитета против кори у обезьян, рожденных позже 1990 года. Следует отметить, что появление источника инфекции среди людей, контактирующих с обезьянами, может привести к возникновению вспышки кори с летальным исходом среди обезьян, как это наблюдались в некоторых приматологических центрах и зоопарках мира. Приостановить распространение инфекции помогло лишь экстренное проведение вакцинации обезьян [3,9]. Следует отметить, что выявленная нами эпизоотологическая ситуация по кори среди обезьян Адлерского питомника (1999-2010 г.г.) кардинально отличается от таковой при обследовании обезьян Сухумского питомника (1982-1983 г.г.) [2]. Антитела к вирусу кори в этот период были выявлены почти у 100% родившихся в питомнике макак, начиная с годовалого возраста. Кроме того, при обследовании в динамике наблюдалось интенсивное естественное инфицирование вирусом кори обезьян, прибывших в питомник из мест их естественного обитания. По данным S.S. Kalter., 1997 [4], антитела к вирусу кори определялись у 67 % обследованных макак, в том числе, у 73 % макак яванских и 45 % макак резусов. Заключение. Получены обобщающие данные о наличии маркеров некоторых вирусных инфекций (гепатит А, гепатит Е, ротавирусной, аденовирусной, энтеровирусной инфекций и кори) у обезьян Адлерского приматологического центра за последнее десятилетие. Общая частота распространения антител к ВГА составила 82,9%, к ВГЕ - 33,2%, к ротавирусу – 99,2%, к аденовирусу – 100 %, к вирусу кори – 7,8%. Различная частота распространения IgG антител к некоторым вирусам у обезьян свидетельствует о различной степени циркуляции этих или антигенно-родственных им вирусов. Изучена зависимость этих показателей от вида обезьян, места и условий содержания. О существовании острых случаев инфекции свидетельствует обнаружение IgM антител (при гепатите А и гепатите Е, вирусного антигена (при ГА, ротавирусной и аденовирусной инфекции), а также РНК энтеровируса (при энтеровирусной инфекции). Литература 1. Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Лазарева И.Я. Частота выявления антител к вирусу гепатита Е у обслуживающего персонала и у макак Адлерского питомника. // Вопр. вирусол. – 2007. - С. 36-40. 2. Шевцова З.В., Корзая Л.И., Федоринов В.В., Васильева В.И. Распространенность респираторных вирусов обезьян и человека среди различных видов обезьян Сухумского питомника. В кн.: Материалы Всесоюзной конференции. Проблемы обеспечения обезьянами медико-биологических исследований в эксперименте. Сухуми, 14-16 ноября 1983 г. - С. 143-144. 3. Choi Y. K., Simon M. A., Kim D. Y. et al. Fatal Measles Virus Infection in Japanese Macaques (Macaca fuscata). // Vet Pathol. - 1999. Vol. 36. – P. 594. 4. Kalter S.S., Heberling R.L., Cook A. W. et al. Viral Infection of nonhuman primates // Lab. Anim. Sci. – 1997. – Vol. 47. – P.149-159. 5. Korzaya L.I., Lapin B.A., Shevtsova Z.V., Krilova R.I. Spontaneous and experimental hepatitis A in Old World monkeys are the models of human hepatitis A. // J. Lab. Anim. Sci., 2001, 11(2), P. 135-141. 6. Purcell R.H, Emerson S.U. Animal models of hepatitis A and E. // ILAR. – 2001. - Vol.42. - No.2. – P.161–177. 7. Wang Yuhuan, Tu Xinming, Humphrey Charles et al. Detection of viral agents in fecal specimens of monkeys with diarrhea. // J. Med. Primatol. – 2007. – Vol. 36. :2. – P. 101–107. 8. Wecterman L.E. Baoming J. Isolation and characterization of a new simian rotavirus YK-1. // Virologi Journal. – 2006. – 3:40. 9. Willy M.E., Woodward R.A., Thornton V.B. et al. Management of a Measles outbreak among Old World nonhuman primates. // Lab. Animal Sci. – 1999. – Vol. 49. – No 1. – P. 42-48. РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ L-ФОРМ СТРЕПТОКОККА ДЛЯ ОБЕЗЬЯН Г.Я.Каган*, Джикидзе Э.К.**, Раковская И.В* * ФГБУ НИИЭМ им. Гамалеи Минздравсоцразвития, Россия **НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия Явление L-трансформации бактерий впервые было описано E. Klieneberger в 1935г. Своё название L-формы получили в честь Листеровского института в Лондоне, где они и были открыты .В нашей стране проблему L-трансформации бактерий изучали В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган, С.В.Прозоровский и их многочисленные ученики и последователи. Эта проблема имеет два аспекта: общебиологический и медицинский. Общебиологический аспект определяется принципиальной возможностью существования бактерий не только в виде обычных бактериальных форм, имеющих клеточную стенку, но и L-форм, лишённых её. Медицинский аспект проблемы определяется ролью L-форм в инфекционном процессе. Указанные выше учёные накопили достаточное количествоa знаний о биологии L-форм: индукции процесса, его индукторов, морфологических и физиологических особенностях, методах их выделения из организма, средах их культивирования. Было показано, что L-формы могут быть стабильными, т.е. способными сохраняться и перевиваться независимо от наличия в среде L-трансформирующих агентов, что связано с необратимой утратой определённых звеньев биосинтеза клеточной стенки и в первую очередь основных компонентов пептидогликана – диаминопимелиновой и мурановой кислот. У них нарушается синтез глюкозамина. Иногда рост стабильных L-форм зависит от трансформирующего агента (например, у пенициллинозависимых L-форм стрептококка) . Нестабильные L-формы при культивировании на средах без L-трансформирующего фактора реверсируют в исходные бактерии. Предполагалось, что патогенность L-форм может быть обусловлена сохранением некоторых факторов патогенности, возможно, появлением новых факторов патогенности, а также реверсией L-форм в родительские бактериальные виды. Для решения всех этих вопросов необходимо было иметь адекватную экспериментальную модель. Приматы являются идеальной экспериментальной моделью для воспроизведения стрептококковой инфекции, т.к. они восприимчивы к этой инфекции, но в естественных условиях не болеют ангиной. Б.А. Лапин и его коллеги Э.К.Джикидзе, Л.А.Секания, Р.Г.Крылова с большим интересом отнеслись .к проблеме . Б.А.Лапин санкционировал наши исследования и постоянно обсуждал с нами полученные результаты. В работе принимала также участие Ж.Шмитт-Сломска - сотрудница Международного Центра детства (Франция). Нам были созданы исключительно благоприятные условия для работы и все сотрудники лаборатории с большой благодарностью вспоминает этот период нашей научной жизни. Работе предшествовало выделение L-форм гемолитического стрептококка группы А из крови больных ревмокардитом, септическим эндокардитом с митральным пороком сердца и недостаточностью кровообращения 2-ой степени. Выделение производили по разработанной авторами схеме: испытуемый материал (кровь) высевали на среды, содержащие и не содержащие L-трансформирующий агент с последующим пересевом на те же среды. Эта схема анализа позволила выявить L-формы в крови 13 из 20 больных, при этом в первичном посеве стрептококки полностью отсутствовали. От 4 больных высевали переходные гетероморфные формы и лишь от 2 больных уже в 1-ом пассаже были выделены культуры стрептококка. Выделенные культуры L-форм отличались полиморфизмом и состояли из зёрен и светопреломляющих тел разной величины и формы. По мере пассирования на среде с пенициллином они приобретали вид типичных L-колоний, состоящих из вакуолизированных форм, шаров, тел неопределённой формы и зернистой массы.В ряде случаев обнаруживали L-формы в стадии реверсии в бактериальные формы, особенно часто на средах без L-индуцирующего агента. Процесс реверсии L-форм в бактериальные и бактериальных в L-формы был тщательно изучен. Выделение L-форм из крови в первичных посевах крови на средах с пенициллином и без него при полном отсутствии роста бактериальных форм позволило прийти к заключению o наличии L-форм стрептококка непосредственно в крови больных. Выделение L-форм гемолитического стрептококка группы А из крови больных людей и факты персистенции возбудителя в виде Л-форм послужили основанием для моделирования патологического процесса путём экспериментального инфицирования животных L-формами стрептококка. Возможность воспроизведения экспериментальной ангины обезьян изучали путём многократного длительного их инфицирования стабильными L-формами гемолитического стрептококка группы А в сравнении с их родительскими культурами. Было использовано два метода заражения: в область параминдальной клетчатки и внутривенно. Инфицирование проводили циклами ( 3 и более ) с интервалом в 4 – 6 месяцев и более, каждый цикл включал 3 – 6 инъекций с интервалами в 6 – 7 дней. В группе с хроническим инфицированием под наблюдением было 12 обезьян Macaca arctoides в возрасте от 3 до 5 лет и 20 обезьян Macacus rhesus в возрасте до одного года. После первого заражения у 3 из 5 обезьян, заражённых L-формами параминдально, появилась лёгкая ангина. Последующие инъекции вызывали усиление реакции, ангины отмечены у 4 обезьян, в том числе у 2 они протекали длительно, с тяжёлыми гнойными налётами. При этом наблюдали значительные изменения рентгенокимограммы: резкие изменения тонической и сократительной функции сердечной мышцы, а также её проводимости. Эти изменения фиксировались уже после второго заражения. Итак, результаты заражения животных L-формами показали , что они , как и бактериальные формы, вызывают ангину, т.е. обладают патогенностью. Ангина развивалась и при внутривенном заражении. Тяжёлое течение ангины с последующим поражением миокарда было в несколько большей степени выражено при заражении обезьян L-формами в сравнении с бактериальными формами. Было показано также, что в организме инфицированных животных под влиянием пенициллинотерапии может происходить индукция L-форм, которые удаётся выделить на протяжении 3 недель после последнего введения возбудителя, что свидетельствует о способности L-форм достаточно длительно персистировать в организме. После завершения этой работы в нашем сотрудничестве в силу известных обстоятельствах был длительный перерыв. Позже наше сотрудничество возобновилось, но уже в области изучения микоплазм – бесстеночных, самых мелких способных к автономному существованию прокариот. Изучению микоплазм обезьян были посвящены две кандидатские диссертации: Балаевой Е.А. и Марантиди А.Н. Обе работы выполнялись в сотрудничестве с нашей лабораторией. Марантиди А.Н. исследовала частоту выявления ахолеплазм у обезьян, их биологические свойства и патогенность. Ахолеплазмы были выделены от животных, находящихся в карантине, а также от животных с различными заболеваниями. Ахолеплазмы выделялись из зева и паренхиматозных органов. От здоровых животных они не были выделены. По биологическим свойствам они были разделены на 5 групп, одна из которых была идентифицирована как A.laidlawii. Другие идентифицировать не удалось. Выделенные штаммы до сих пор хранятся в музее нашей лаборатории. Балаева Е.Я. показала, что у макаков резусов и зелёных мартышек микоплазмо-носительство встречается достаточно часто (12,6%) , у павианов-гамадрилов реже (3% ). При различных формах гемоцитобластоза с наибольшей частотой микоплазмы обнаруживали при тяжёлых формах процесса. Частота выявления микоплазм чётко коррелировала с тяжестью заболевания, что расценивалось как результат активации латентной микоплазменной инфекции на фоне снижения иммунологической реактивности. Во всех случаях была отмечена диссеминация микоплазм во все органы, что приводило к спленомегалии и лимфоаденопатии. Инфекция характеризовалась хроническим течением: клинические проявления сохранялись в течение 8 мес.-1,5 лет. Микоплазмы по наблюдениям и Марантиди А.Н. и Балаевой Е. Я. длительно персистировали в крови и органах животных ( 60 дней – предельный срок наблюдений ). Продолжением совместных работ стали исследования Джикидзе Э.К и Аршба И.М., результаты которых будут представлены в отдельном докладе. RESULTS OF MONKEY STREPTOCOCCUS L-FORM PATHOGENICITY STUDY G.Kagan , E. Dzhikidze, I.V. Rakovskaya The pathogenicity of streptococcus L-forms isolated from blood of patients with septic endocarditis, rhemocarditis and with heart disease insufficiency of blood circulation was studied on monkey.The basic achievements of this work are:It was possible to show that L-forms retain path quinsy complicated myocarditisIt was possible the induction of L-forms in organism of the infected animals under influence penicillin therapeutics. It was possible to isolate L-forms from blood during 3 weeks after last introduction, i.e. long persisted in organism. ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ МИКОПЛАЗМ В КРОВИ ОБЕЗЬЯН АДЛЕРСКОГО ПИТОМНИКА. Горина Л.Г.*, Аршба И.М.**, Гончарова С.А.*, Джикидзе Э.К.** * ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи Минздравсоцразвития России. ** НИИ медицинской приматологии РАМН, Сочи, Россия. В последние годы возрос интерес к изучению роли микоплазм и уреаплазм в этиологии воспалительных заболеваний урогенитального тракта человека. Исследования последних десятилетий свидетельствуют о том, что их широкое распространение является достаточно серьезной угрозой для репродуктивного здоровья населения, т.к. микоплазмы и уреаплазмы могут быть причиной бесплодия, различных видов патологии беременности и родов [5, 11, 12, 13]. Микоплазмы выявляют в мочеиспускательном канале у мужчин, чаще всего при негонококковых уретритах (НГУ), а также во влагалище и цервикальном канале при заболеваниях мочеполовых органов у женщин. Имеются сообщения о выделении микоплазм при простатитах, эпидидимитах, при осложненной беременности, пиелонефритах, болезни Рейтера [7, 13]. Моделирование инфекционного процесса на лабораторных животных (крысах, морских свинках и др.) показало длительную персистенцию микоплазм в организме лабораторных животных. К сожалению, в большинстве случаев не удалось полностью воспроизвести клиническую картину этих инфекций [5, 7]. Так, непосредственное введение М. hominis в маточные трубы обезьян вызывало у них развитие сальпингитов и параметритов [9]. По данным Tully и др. (1986) из 26 разных видов обезьян (18 самцов и 8 самок), инфицированных внутриуретрально M.genitalium. наиболее восприимчивыми оказались шимпанзе (Pan troglodytes), а более резистентными - Macaca mulatta и Macaca fascicularis [14]. Полученные авторами результаты свидетельствуют о существенной роли М genitalium в заболеваниях урогенитального тракта высших приматов, которая может играть определенную роль в возникновении инфекционного процесса половых путей человека [10, 14]. Стойкая антигенемия с поздним синтезом специфических антител наблюдалась у 5 обезьян Trachypithecus cristatus, инфицированных M. fermentans (incognitus) которые погибли в течение 7- 9 месяцев после заражения (15). Показано также, что ахолеплазмы патогенны для обезьян и могут явиться причиной развития хронических вялотекущих нефритов и циститов [3, 4]. Введением чистой культуры U. urealyticum в уретру Jansch H.H. (1972) спровоцировал у себя возникновение уретрита, причем в отделяемом были обнаружены уреаплазмы. После адекватной терапии возбудители исчезли вместе с симптомами уретрита [6]. Другие исследователи также указывают на то, что введение микоплазм человеку вызывает воспалительные процессы мочеполовой системы [11]. Учитывая все данные, свидетельствующие о высокой чувствительности приматов ко многим возбудителям инфекционных заболеваний человека, в том числе и к микоплазмам, особый интерес представляет влияние естественного носительства указанных возбудителей на восприимчивость данных животных при экспериментальном заражении. Цель работы заключалась в выявлении антигенов микоплазм и антител к ним в пробах сыворотки крови обезьян, как при бессимптомном носительстве, так и инфицированных M.hominis и U.urealyticum. Материалы и методы Исследования проводили в лаборатории микоплазм и Л-форм бактерий и НИИ МП РАМН на базе Адлерского питомника обезьян. Материалом для исследования служили пробы сыворотки крови от 51 обезьяны рода макак (43 резуса, 8 яванских), обоего пола: 41 самка (28 носителей, 13 с патологией УГТ) и 10 самцов, возраста от 2 до 25 лет. Антигены микоплазм и уреаплазм определяли в реакции агрегат-гемагглютинации (РАГА), антитела к ним в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Для выявления IgG и IgМ антител использовали иммуноферментный анализ (ИФА). Диагностические препараты и методики постановки данных реакций разработаны в лаборатории микоплазм и Л-форм бактерий [1, 2]. Статистическую обработку проводили по формулам, рекомендованным Ашмариным И.П. и Воробьевым А.А. Результаты и обсуждение Результаты исследования проб сыворотки крови обезьян (n-51), представленные в таблице №1, свидетельствуют о том, что частота определения антигенов M.hominis и U.urealyticum в РАГА составила 33,3±6,6 и 43,1±6,8%% соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что антигены M.hominis присутствовали у трети всех обследованных обезьян, а антигены U.urealyticum почти у каждой второй особи. В ИФА и РПГА у части обезьян обнаруживали антитела к M.hominis и U.urealyticum. Таблица №1 Обнаружение в сыворотке крови антигенов M. hominis и U. urealyticum и антител к ним Кол-во обследованных обезьян Инфекционный агент Антитела в ИФА Антигены в РАГА Антитела (общие) в РПГА IgG IgM 51 M. hominis 16 31,3±6,4% 21 42,0±6,9% 16 31,3±6,6% 8 5,6±5,0% 51 U. urealyticum 32 62,7±6,7% 30 58,8±6,8% 22 43,1±6,8% 16 31,1± 6,4% Так, антитела класса М к M.hominis выявляли чаще, чем антитела класса G - 42 и 31,3%% соответственно. Эти результаты могут отражать процессы повторного инфицирования обезьян, либо первичного заражения. В некоторых случаях одновременно обнаруживались антитела классов G и M, часто это свидетельствует о хроническом течении инфекционного процесса. Следует отметить, у 4 из 16 обезьян отсутствовали антитела к M.hominis, а у 6 особей имелись и антигены и антитела. Титры антител классов М колебались в пределах от 1:800 до 1:1600 (в среднем 1040+52,21), G - от 1:200 до разведения 1: 3200 (в среднем 781,3 + 101,19). Частота обнаружения антител к U.urealyticum классов G - и М составила 62,7% и 58,5% соответственно, при этом в 22 случаях были выявлены антитела этих двух классов. Титры антител классов М колебались в пределах от 1:800 до 1:1600 (в среднем 1040+52,21), G - 1:200 -1: 3200 (в среднем 781,3 + 101,19). В РПГА специфические антитела к M.hominis и U.urealyticum обнаруживали в 15,6 и 31,1%% случаев соответственно, т.е. чувствительность этой реакции значительно уступала чувствительности ИФА. Не всегда персистенция антигенов M.hominis в организме обезьян сопровождалось синтезом специфических антител. Так, у 4 из 16 обезьян отсутствовали антитела к М. hominis , а у 6 особей присутствовали как антигены, так и специфические антитела. Одновременное обнаружение антигенов U.urealyticum и антител к ним было зарегистрировано у 13 из 22 обезьян. Следует отметить, что частота обнаружения антител к U.urealyticum примерно в два раза выше, чем к М. hominis. Высокая частота обнаружения антител класса М, как к М. hominis, так и к U.urealyticum, может свидетельствовать о свежем инфекционном процессе у обезьян, течение которого в большей части случаев не имеет выраженных клинических симптомов. Выявление антигенов методом РАГА (33,3% к М. hominis и 43,1 % U.urealyticum) также является показателем инфицированности обезьян данными микроорганизмами, что свидетельствует о распространенности носительства среди обезьян в условиях неволи. Более детальная расшифровка распространения инфекции, обусловленной М. hominis и U.urealyticum, среди самок и самцов показала следующее: у самок показатели присутствия антигенов U.urealyticum и антител к ним составили 58,5%, у самцов – 70%. Для М. hominis аналогичные показатели были в 1,5 раза ниже. Из всех обследованных самок (41 животное) у 13 в анамнезе были зарегистрированы спонтанные аборты, мертворождения, патологические роды и др. Остальные 28 обезьян были клинически здоровы. В таблице №2 представлены результаты их обследования. Показано, что антитела классов G и М чаще обнаруживали у больных, чем у здоровых самок. У 10 из 13 больных самок выявлялись одновременно антитела классов G - и М к U.urealyticum. Таблица №2 Обнаружение антител класса G и М у обезьян (самок) методом ИФА. Кол-во обезьян M.hominis U.urealyticum IgG IgM IgG IgM Здоровые (n=28) 6 21,5±7,6% 12 42,8±9,2% 14 50,0±9,4% 11 35,7±8,6% Больные (n =13) 7 53,8±13,6% 6 (46,1± 13,6%) 11 84,6±9,8% 12 2,3±23,1% Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что среди обезьян Адлерского питомника широко распространено носительство как М. hominis, так и U.urealyticum. Этот вывод подтверждается обнаружением антигенов и специфических антител к ним в пробах сыворотки крови как здоровых носителей, не имеющих клинических проявлений, так и у обезьян с патологией урогенитального тракта (аборты, мертворождения, патологические роды и др.). При этом достоверно показано, что у обезьян с неблагополучным акушерским анамнезом микоплазмы и уреаплазмы выявлялись чаще, чем у здоровых. Эти результаты свидетельствуют о распространенности носительства микоплазм человека среди обезьян в условиях неволи. Все это дает нам основание рекомендовать обезьян в качестве моделей для экспериментального изучения роли М. hominis и U.urealyticum в патологии урогенитального тракта, а естественную инфекцию использовать для испытания эффективности новых антимикоплазменных препаратов. Литература: 1. Горина Л.Г., Гончарова С.А., Игумнов А.В. Лабораторная диагностика респираторного микоплазмоза человека. Вестник АМН СССР. 1991, 6: 44-47. 2. Горина Л.Г., Саламова Р.Э. Цветков В.С., Прозоровский С.В. Выявление антител к Мусор1аsma arthritidis и Мусор1аsma fermentans у больных ревматоидным артритом иммуноферментным методом. Журн. микробиол.1985, 6: 48-52. 3. Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. Спонтанные микоплазмозы обезьян. Бюлл.эксп.биол. мед. 2001, 132(12): 678-684. 4. Марантиди А.Н. Вульфович Ю.В., Гамова Н.А. Инфекция обезьян, вызванная U. uгеа1yticum 8 серотипа. Журн. микробиол. 1990, 6: 13-18. 5. Прозоровский С.В. Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология. М., Медицина, 1995. 6. Jansch H.H. Pathogenitatsnachweiss fur harnstoffsplatende Mycoplasmen im menschlichen Urogenitaltrakt im Selbstver-such//Hautarzt. 1972. - № 23: 558 - 565.) 7. Fodor M. Difference in the virulence of Ureaplasma urealyticum isolates.Acta Microbiol. Acad. Science Hungari. 1980, 27 (2): 161-169. 8. Furr P.M., Hetherington C.M. and Taylor-Robinson D. Studies of the specificity of ureaplasmas for marmosets. J. Microbiol. 1978, 11: 537-540. 9. Moller B.R., Freundt E.A., Black F.T. et.al. Experimental infections of the genital tract of female givet monkeys by Mycoplasma hominis. Infect.Immun., 1978, 20: 248. 10. Ross J. D. C., J. S. Jensen. Mycoplasma genitalium as a sexually transmitted infection: implications for screening, testing, and treatment. Sex Transm Infect 2006, 82:269-271. 11. Taylor-Robinson D.,Csonka G.W.,Prentice M.J. Human intra-urethral inoculation of ureaplasmas. 1977, QJI med., 46: 109. 12. Taylor-Robinson D. Infections due to species of Mycoplasma and Ureaplasma. Clin.Infect. Dis. 1996, 23: 671-684. 13. Thomson A.S. Occurrences and pathogenecity of Mycoplasma hominis in the upper tract: a review. Sex.Trans.Dis. 1983, 10: 323-326. 14. Tully J.G., Taylor-Robinson D., Rose D.L. et.al. Urogenital challendge of primate species with M.genittalium and characteristics of infection induced in chimpanzees.J.of infect.Dis. 1986, v.1 53, № 6. 15. Shyh-Ching Lo, Douglas J. Wear, James W.-K. Shih, Fatal Systemic Infections of Nonhuman Primates by Mycoplasma fermentans (incognitus) Strain. Clinical Infect. Dis., 1993, v.17: 283-S288, MYCOPLASMA ANTIGEN DETECTION IN BLOOD OF ADLER PRIMATE CENTER MONKEYS L. Gorina*, I. Arshba**, S. Goncharova*, E. Dzhikidze** * Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia. **Research Institute of Medical Primatology, Adler, Russia. Monkeys living in captivity in open-air large cages or in small group cages, often had mycoplasma infection. M. hominis antigens in monkey blood have been revealed in 33,3 % of cases, and antibodies to them - in 15,6 %. IgM antibodies to M. hominis were found more frequently than IgG antibodies. Eight monkeys had both classes of antibodies (IgM and IgG) simultaneously. Frequency of U. urealyticum antigen detection was 43,1 % and specific antibodies were detected in 31,1 % of cases. IgG antibodies to U.urealyticum were revealed more often than IgM antibodies. In 22 cases both antibodies classes have been revealed. High frequency of detection of M. hominis and U.urealyticum antigens and antibodies in the blood both of healthy animals and monkeys with pathology of urogenital tract supporting the prevalence of carriage of human mycoplasmas by monkeys in the conditions of captivity. СТЕНДОВЫЕ ДОКЛАДЫ РЕПРОДУКЦИЯ РНК - И ДНК – СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO Подчерняева Р.Я., Исаева Е.И. ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, Москва, РФ. Начиная с 1995 г., Всемирная организация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендует разрабатывать гриппозные вакцины с использованием в качестве субстрата перевиваемые культуры клеток, аттестованные в соответствии с международными требованиями (8). Эти культуры клеток обладают рядом преимуществ, в том числе: способностью культивироваться в системах с развитой поверхностью (роллерах и биореакторах), в бессывороточных средах или средах с пониженным содержанием сыворотки; возможностью применения стандартной клеточной культуры на протяжении длительного времени для работы с вакцинными штаммами; возможностью получения вирусной биомассы вакцинных штаммов с неизменными антигенными свойствами (2,3,7). В нашем институте получена вакцинная линия клеток Vero(B), охарактеризованная по требованиям ВОЗ и применяемая не только для научных исследований, но и для получения противогерпетической вакцины (1,6). Объектом данного исследования являлась перевиваемая линия клеток почек зеленой мартышки (Vero) из Коллекции ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (4). Цель исследования состояла в сравнительной оценке динамики репродукции различных РНК- и ДНК- содержащих вирусов в клетках Vero. Применяли традиционный метод заражения монослоя клеток (в посевной концентрации 2,0х105 кл/мл), выращенный на 24-луночных панелях (фирмы Costar) различными вирусами в соответствующих питательных средах с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС)(фирмы Hy Clone). Для вирусов гриппа обязательно применяли трипсин (фирма Sigma) в концентрации 2 мкг/мл. После удаления питательной среды и промывания монослоя клеток раствором Хенкса их заражали серией десятикратных разведений вирусов с 10-1 по 10-7 в объеме 100 мкл на лунку. Через 40 мин монослой клеток отмывали и добавляли по 1,0 мл среды без ЭТС. Клетки инкубировали при 370С в течение 48 ч. После этого в культуральной жидкости определяли инфекционный титр вирусов (в lgТЦД50) путем титрования по методу Рида и Менча и титр гемагглютининов (ГА) в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами человека 0(1) группы крови. В таблице 1 представлена репродукция вирусов гриппа человека, птиц и свиней с интервалами пассирования в 72 ч. в процессе культивирования (3 пассажа) в культуре клеток. Видно, что наиболее активно репродуцировался в этих клетках птичий вирус гриппа Н5N1 (инфекционный титр 5,5 lg ТЦД50 и титр ГА – 1/64). Эталонный штамм вируса гриппа свиней в клетках Vero не репродуцируется совсем. Что касается разных типов вирусов гриппа человека, то можно отметить их способность к репродукции в клетках Vero практически в одинаковой степени. Важно, что инфекционные титры у всех штаммов возрастают в процессе пассирования на 1-2 lg ТЦД50, а титры гемагглютининов в 8 раз (3 пассаж). Т.е. клетки Vero можно считать пермиссивной системой для репродукции вирусов гриппа человека и птиц. Таблица 1 Репродукция вирусов гриппа человека, птиц и свиней в культуре клеток Vero. № п/п Вирусы гриппа Штаммы Пассаж Инфекционный титр вируса (lgТЦД50) Титр ГА 1 H1N1 А/Брисбен 59/07 1 2 3 2,0 2,5 3,0 2 4 16 2 H3N2 А/Брисбен 10/07 1 2 3 1,0 2,0 3,0 4 16 32 3 B В/Флорида 04/06 1 2 3 1,5 2,0 3,5 4 8 16 4 H5N1 А/Утка/Новосибирск 56/05 1 2 3 3,0 5,0 5,5 8 32 64 5 cвиней А/Калифорния 7/09 1 2 3 - - - - - - Обозначения: - вирус не репродуцируется в клетках Параллельно нами проведено изучение репродукции этих вирусов на культуре клеток почек собаки (МДСК), считающихся наиболее чувствительной клеточной линией для репродукции вирусов гриппа типа А и В. Действительно, нами показано, что штамм А/Брисбен 59/07 (H1N1) в этих клетках репродуцируется после 3 пассажей до инфекционного титра 6,0 lgТЦД50 и титра ГА 1/512. Штамм А/Брисбен 10/07 (Н3N2) до титра 4,5 lgТЦД50, ГА – 1/32, штамм В/Флорида 04/06 – до 5,0 lg ТЦД50, ГА – 1/16, а птичий вирус Н5N1 – до 6,0 lg ТЦД50, ГА – 1/256 соответственно. В клетках МДСК, в отличие от клеток Vero, слабо репродуцируется (до 2,0 lg ТЦД50) вирус гриппа свиней (штамм А/Калифорния 7/09). Т.е. проведенные сравнительные исследования динамики накопления различных штаммов вирусов гриппа показали, что для производства инактивированной вакцины перевиваемые клетки МДСК и Vero могут заменить субстрат полученный на куриных эмбрионах. Помимо изучения репродукции вирусов гриппа человека, птиц и свиней нами проведены исследования по выяснению способности размножения в клетках Vero других типов вирусов (Таблица 2). Таблица 2 Репродукция вирусов герпеса, адено-, метапневмо- и корона- в культуре клеток Vero. № п/п Вирусы Штамм Пик репродукции (в сутках) Инфекционный титр вируса (lgТЦД50) 1 Метапневмовирус человека HMPV-1 20 3,8 2 Аденовирус человека 2 типа 3 3,1 3 Аденовирус человека 5 типа 3 4,3 4 коронавирус NL-63 - - 5 Герпес I типа УC 1 6,4 6 Герпес II типа ВН 3 5,2 Из таблицы видно, что из 6 изученных вирусов только один корона вирус не размножается в этих клетках. Наиболее активно репродуцируются вирусы герпеса I и II типов (до инфекционных титров 6,4 и 5,2 lgТЦД50 соответственно). Из аденовирусов человека более активно репродуцируется 5 тип (4,3 lgТЦД50) по сравнению с 2 типом (3,1 lgТЦД50). Отечественный штамм НМPV-1 метапневмовируса человека способен репродуцироваться в клетках Verо (3,8 lgТЦД50), но пик репродукции отмечен только на 20 сутки культивирования в отличие от других изученных вирусов (на 3 сутки, а штамм УС даже через 1 сутки). Таким образом, клеточную линию Vero можно считать пермиссивной и для изучения других типов вирусов (в частности герпеса и аденовируса). Список литературы 1. Бархалева О.А., Лодыженская И.П., Воробъева М.С., Шалунова Н.В., Подчерняева Р.Я. и др.// Вопросы вирусологии, -2009, -№5, - С.33-34. 2. Исаева Е.И., Мазуркова Н.А., Скарпович М.О. и др.// Оптимизация роллерного культивирования вакцинных штаммов вирусов гриппа А и В в культурах клеток МДСК и Vero при использовании компонентов растительного происхождения// Биотехнология, 2010,- №6, - С.55-62. 3. Kaverin N.V., Webster R.G. Impairment of multicycle influenza virus growth in Vero (WHO) cells by loss of trypsin activity // J.Virol/ 1995.-V.69.-p.2700-27003. 4. Каталог Всесоюзной Коллекции Клеточных культур. Изд. «Наука», Л, -1991.-117 С. 5. Михайлова Г.Р., Мазуркова Н.А., Подчерняева Р.Я. и др. Морфологическая и кариологическая характеристика клеток МДСК и Vero(В) при культивировании в питательных средах на основе растительных гидролизатов.// Вопросы вирусологии, -2011,-№2,-С.9-14. 6. Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Михайлова Г.Р. Линия клеток Vero(B) для приготовления медикобиологических препаратов.//Вопросы вирусологии – 1996.-№4.- С.183-185. 7. Sheets R.L. et al. Vaccine cell substrates//Expert Rev.Vaccines.-2004.-V.-3, p.633-638. 8. WHO cell culture as a substrate for the production of influenza vaccine: memorandum from a WHO meeting//Bull Wed Heth Org.- 1995?- V.73.- p.431-435. THE REPRODUCTION OF RNA AND DNA VIRUSES IN THE CULTURED VERO CELLS R. Podchernyaeva, E. Isaeva D.I.Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow, Russia. The paper presents the results of the reproduction human influenza viruses - (H1N1,H3N2, B) avian influenza H5N1 virus, pandemic influenza virus A/California 07/ 2009, herpes simplex virus types 1 (US strain) and types 2 (VN strain), human adenoviruses types 2 and 5, human metapneumovirus (strain HMPV –1) in the Vero continuous cell line.